戴意強(qiáng)，劉輝,2，劉恩岐,2，陳安徽,2，陳尚龍,2*

(1.徐州工程學(xué)院 食品(生物)工程學(xué)院，江蘇 徐州 221018；2.徐州工程學(xué)院 江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221018)

Cd不是人體必需的元素，其毒性較大，一般通過食物鏈進(jìn)入人體，并在人體內(nèi)富集，嚴(yán)重威脅人體健康[1,2]，眾所周知的“骨痛病”就是由Cd中毒引起的[3]。因此，在食品中對Cd限量有嚴(yán)格的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[4]。適當(dāng)?shù)臉悠非疤幚砜梢杂行У亟档突w干擾，常用的前處理方法有干法灰化、濕法消解和微波消解。干法灰化耗時短，但操作簡單，用酸量小，空白值低[5]；濕法消解用酸量大，產(chǎn)生大量有毒有害氣體，但用時短，待測元素?fù)]發(fā)損失小[6]；微波消解需要特殊儀器設(shè)備，消解樣品量較小，但耗時短、用酸量小、空白值低[7-9]。

本試驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)室所研制的發(fā)酵香腸作為研究對象[10-12]，采用石墨爐原子吸收光譜法(GFAAS)測定發(fā)酵香腸中Cd的含量[13-18]。利用單因素試驗(yàn)，考察各因素對Cd吸光度的影響，選出最佳的基體改進(jìn)劑[19,20]，在此基礎(chǔ)上通過正交試驗(yàn)確定最佳樣品前處理方法、基體改進(jìn)劑添加體積、灰化溫度和原子化溫度，建立GFAAS測定發(fā)酵香腸中Cd的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵香腸：實(shí)驗(yàn)室研發(fā)產(chǎn)品。

1.000 g/L Cd標(biāo)準(zhǔn)溶液：國家化學(xué)試劑質(zhì)檢中心；磷酸二氫銨、濃HNO3、30% H2O2(V/V)：均為優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；十二烷基硫酸鈉、抗壞血酸、乙二胺四乙酸、檸檬酸、酒石酸、(NH4)2SO4、Mg(NO3)2、Pd(NO3)2：均為分析純，天津福晨化學(xué)試劑廠；18.2 MΩ·cm超純水；氬氣(純度>99.99%)。

1.2 儀器與設(shè)備

Contra AA 700連續(xù)光源原子吸收光譜儀(配有MPE60自動進(jìn)樣器，簡稱HR-CS AAS) 德國Analytic Jena公司；XT-9900型智能微波消解儀及預(yù)處理裝置、XT-9800型多用預(yù)處理加熱儀 上海新拓微波溶樣測試技術(shù)公司；KSL-1400X-A2 智能箱式高溫爐 合肥科晶材料技術(shù)公司；220V-AC電子可調(diào)萬用電爐(0～2000 W) 上海樹立儀器儀表公司；FA-2004B電子天平(精度0.1 mg) 上海越平科學(xué)儀器公司；CascadaTM智能實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng) 美國頗爾公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵香腸工藝流程

原料肉處理(肥瘦分割)→腌制→絞肉→加入發(fā)酵劑→灌腸(包括結(jié)扎和排氣)→發(fā)酵→干燥→成熟→貯藏。

1.3.2 儀器工作參數(shù)

HR-CS GFAAS測定Cd工作參數(shù)：分析譜線為228.8018 nm，載氣為高純氬氣，進(jìn)樣體積為20 μL；Cd元素原子化過程溫度參數(shù)：灰化溫度、原子化溫度分別為800，1500 ℃，原子化程序升溫速度為1400 ℃/s；基體改進(jìn)劑：10 g/L磷酸二氫銨(加入體積5 μL)。

1.3.3 基體改進(jìn)劑溶液的配制

磷酸二氫銨溶液(10 g/L)：先將1.00 g磷酸二氫銨放入燒杯中，加入0.5% HNO3(V/V)充分溶解，并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，并以0.5% HNO3(V/V)定容至刻度，搖勻。

按上述方法，配制酒石酸溶液(1 g/L)、檸檬酸溶液(1 g/L)、抗壞血酸溶液(1 g/L)、十二烷基硫酸鈉溶液(1 g/L)、乙二胺四乙酸(飽和溶液)、(NH4)2SO4溶液(1 g/L)、Pd(NO3)2溶液(1 g/L)、Mg(NO3)2溶液(1 g/L)。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的配制

用0.5% HNO3(V/V)將Cd標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.000 g/L)逐級稀釋至5.00 μg/L Cd標(biāo)準(zhǔn)使用液，再將其置于MPE自動進(jìn)樣器中，設(shè)置5個質(zhì)量濃度梯度(0.50，1.25，2.50，3.75，5.00 μg/L)。

1.3.5 樣品前處理方法

干法灰化：稱取1.0～1.2 g經(jīng)粉碎、攪勻的發(fā)酵香腸(精確至0.1 mg)置于坩堝中，炭化至無煙后，轉(zhuǎn)移至箱式高溫爐中，高溫灰化(500 ℃，8 h)，待灰分冷卻至室溫后，用1% HNO3(V/V)充分溶解，溶解液和坩堝洗滌液經(jīng)過濾后轉(zhuǎn)移至規(guī)格為25 mL的容量瓶中，定容至刻度，搖勻備用；同時以同樣方法做空白試驗(yàn)。

濕式消解：取0.4～0.5 g樣品(精確至0.1 mg)和10 mL混合酸(硝酸∶高氯酸為9∶1，V/V)置于具塞錐形瓶中，先振蕩均勻后放置過夜，再加熱消解，直至冒白煙，待消解液冷卻后，用1% HNO3(V/V)洗入規(guī)格為10 mL容量瓶中，再用1% HNO3(V/V)定容至刻度，搖勻備用；同時以同樣方法做空白試驗(yàn)。

微波消解：將0.4～0.5 g樣品(精確至0.1 mg)、5 mL濃 HNO3和2 mL 30% H2O2(V/V)一起置于微波消解罐中，經(jīng)輕微震蕩、混勻后進(jìn)行微波消解，待消解完畢后，用小火加熱除酸至近干，用1% HNO3(V/V)洗入規(guī)格為10 mL的容量瓶中，定容至刻度，搖勻備用；同時以同樣方法做空白試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 基體改進(jìn)劑種類的選擇

發(fā)酵香腸成分較為復(fù)雜，含有大量蛋白質(zhì)、脂肪等有機(jī)成分和無機(jī)鹽成分，添加適當(dāng)?shù)幕w改進(jìn)劑可以防止灰化過程中Cd的損失，有效地改善吸收峰形和提高Cd的吸光度。將基體改進(jìn)劑種類作為試驗(yàn)變量，研究基體改進(jìn)劑種類對Cd吸光度的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 基體改進(jìn)劑對吸光度的影響Fig.1 Effect of matrix modifier on absorbancy

由圖1可知，不同基體改進(jìn)劑對Cd的吸光度影響差異很大，其中10 g/L NH4H2PO4影響最顯著。因此，試驗(yàn)選擇10 g/L NH4H2PO4作為測定Cd的基體改進(jìn)劑。

2.1.2 基體改進(jìn)劑添加體積的優(yōu)化

加入適量的基體改進(jìn)劑可以得到穩(wěn)定性和重現(xiàn)性更好的吸收峰。將基體改進(jìn)劑添加體積作為試驗(yàn)變量，固定其他試驗(yàn)因素，利用GFAAS測定Cd的吸光度，結(jié)果見圖2。

圖2 基體改進(jìn)劑添加體積對吸光度的影響Fig.2 Effect of matrix modifier volume on absorbancy

由圖2可知，吸光度大小隨基體改進(jìn)劑添加體積的增大而增加，然后趨于穩(wěn)定，并伴隨小幅下降。當(dāng)基體改進(jìn)劑添加體積為5 μL時，Cd的吸光度達(dá)到最大值。

2.1.3 灰化溫度的優(yōu)化

灰化溫度過低會使樣品中基體殘留，灰化溫度過高會使樣品中Cd元素?fù)p失，這兩種情況都會影響Cd的吸光度。將灰化溫度作為試驗(yàn)變量，固定其他試驗(yàn)因素，利用GFAAS測定Cd的吸光度，結(jié)果見圖3。

圖3 灰化溫度對吸光度的影響Fig.3 Effect of ashing temperature on absorbancy

由圖3可知，當(dāng)灰化溫度小于800 ℃時，Cd的吸光度上升明顯；當(dāng)灰化溫度大于800 ℃時，Cd的吸光度明顯下降，表明過高的灰化溫度導(dǎo)致待測元素受到了損失。

2.1.4 原子化溫度的優(yōu)化

GFAAS原子化階段的作用是產(chǎn)生原子蒸汽，原子化溫度會影響測定的準(zhǔn)確度和靈敏度，因此在測定Cd吸光度過程中，需要選擇合適的原子化溫度。將原子化溫度作為試驗(yàn)變量，固定其他試驗(yàn)因素，利用GFAAS測定Cd的吸光度，結(jié)果見圖4。

圖4 原子化溫度對吸光度的影響Fig.4 Effect of atomizing temperature on absorbancy

由圖4可知，當(dāng)原子化溫度在1300～1600 ℃時，Cd吸光度隨原子化溫度升高而增加，當(dāng)原子化溫度大于1600 ℃時，Cd的吸光度隨原子化溫度的增加而緩慢下降。

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方差分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以前處理方法、基體改進(jìn)劑添加體積、灰化溫度和原子化溫度為影響因素，以Cd的吸光度為指標(biāo)，選用L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[21]，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1，對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Orthogonal experimental design and results

由表1可知，4個因素對吸光度的影響順序?yàn)锳>B>C>D，即前處理方法>基體改進(jìn)劑添加體積>灰化溫度>原子化溫度，其中前處理方法對吸光度的影響最強(qiáng)，且分析最佳測定條件為A1B2C2D1。

表2 正交試驗(yàn)方差分析Table 2 Variance analysis of orthogonal experiment

注：F0.05(2,2)=19.00，P<0.05，*表示影響顯著。

由表2可知，前處理方法對吸光度的影響顯著(P<0.05)，基體改進(jìn)劑添加體積、灰化溫度和原子化溫度對吸光度的影響不顯著。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果的可靠性與重現(xiàn)性，在分析最佳測定條件下，重復(fù)測定6次，得到吸光度的平均值為0.1691(高于試驗(yàn)最佳吸光度0.1675)，RSD=3.43%。因此最佳測定條件為A1B2C2D1，即前處理方法為干法灰化，基體改進(jìn)劑添加體積為5 μL，灰化溫度為800 ℃，原子化溫度為1500 ℃。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

通過Aspect CS軟件設(shè)置Cd的檢測方法，使用HR-CS GFAAS進(jìn)行順序測定。以標(biāo)準(zhǔn)液所配制的Cd質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、所測定的Cd吸光度為縱坐標(biāo)，利用軟件繪制非線性標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，所得方程為A=(0.0265347+0.207538×c)/(1+0.1421586×c)，相關(guān)系數(shù)為0.9979，特征質(zhì)量濃度為0.04 μg/L，測定結(jié)果表明Cd的質(zhì)量濃度在0.50～5.00 μg/L范圍內(nèi)，Cd的質(zhì)量濃度與吸光度呈現(xiàn)良好的關(guān)系。

2.4 樣品測定和回收率試驗(yàn)

發(fā)酵香腸經(jīng)干法灰化后，在最優(yōu)測定條件下平行測定6次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算得出發(fā)酵香腸中Cd的平均含量為18.24 μg/kg，此含量小于國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 2762-2012)中的限量(100 μg/kg)，RSD=3.67%。將一定量Cd的標(biāo)準(zhǔn)溶液和發(fā)酵香腸一起進(jìn)行干法灰化(加標(biāo)水平為20 μg/kg)，在最優(yōu)試驗(yàn)條件下平行測定6次，計(jì)算得樣品平均加標(biāo)回收率為97.3%，RSD=2.86%，表明使用該方法測定發(fā)酵香腸中Cd，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)，試驗(yàn)選擇10 g/L NH4H2PO4作為測定Cd的基體改進(jìn)劑，系統(tǒng)地分析了影響發(fā)酵香腸中Cd測定的因素；再通過正交試驗(yàn)，篩選出最優(yōu)測定條件，即采用干法灰化進(jìn)行前處理，添加基體改進(jìn)劑體積為5 μL，石墨爐灰化溫度和原子化溫度分別800，1500 ℃；在此條件下，測定發(fā)酵香腸中Cd的含量為18.24 μg/kg，低于國家標(biāo)準(zhǔn)，加標(biāo)平均回收率為97.3%，且RSD≤3.67%。

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