徐悅，張衛(wèi)明，馬世宏，聶韡，單承鶯*

(1.南京師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，南京 210097；2.南京野生植物綜合利用研究院，南京 210042)

芫荽(CoriandrumsativumL.)，又名香菜、胡荽等，傘形科芫荽屬，是一種1年生或2年生的草本植物。芫荽原產(chǎn)于歐洲地區(qū)，早于漢代引入我國，目前內(nèi)大部分省份地區(qū)均有種植，是人們熟知的餐桌上的調(diào)味蔬菜。芫荽中含有豐富的營養(yǎng)成分，具有抗氧化、降血糖、抗焦慮等藥理作用，在臨床上也有一定的食療作用[1]。目前對芫荽提取物的活性研究的報道大多集中于極性溶劑提取物[2-5]，對其水提物的活性研究甚少，芫荽作為一種常見的可食用的香辛蔬菜，同時又是一種全株可入藥的藥用植物，關(guān)注并研究其水提物的活性同樣具有廣泛的應(yīng)用意義。本實驗主要研究了芫荽成熟莖葉和籽實兩部分的水提物的抗氧化活性和抑制α-葡萄糖苷酶的作用效果，以期為更好地開發(fā)利用芫荽植株提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

成熟期芫荽莖葉和芫荽籽：均采自江蘇省南京市高淳區(qū)，經(jīng)南京野生植物綜合利用研究院肖正春教授鑒定為傘形科芫荽屬(CoriandrumsativumL.)的莖葉和籽實。

1.2 實驗試劑和儀器

1.2.1 試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：購自北京百靈威科技有限公司；DPPH：購自上海麥克林公司；α-葡萄糖苷酶、阿卡波糖：購自上海源葉科技有限公司；PNPG：購自阿拉丁試劑(上海)有限公司；其余試劑：均為國產(chǎn)分析純。

1.2.2 儀器

電子分析天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司；高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；T6紫外/可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；Thermo Scientific Multiskan FC 酶標(biāo)儀 賽默飛世爾(上海)儀器有限公司；臺式微量高速離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮儀器廠；數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州天瑞儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理和提取物制備

將芫荽籽置于烘箱中，105 ℃烘干，粉碎后過40目篩，備用。成熟芫荽莖葉洗凈，晾干，再于烘箱中105 ℃烘干，剪碎后備用。分別取適量芫荽籽和芫荽莖葉，加入蒸餾水，料液比均為1∶10，加熱至微沸，水提3 h，濾去殘渣，濾液減壓濃縮干燥制得水提物浸膏。

1.3.2 提取物總黃酮含量的測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備，參考文獻(xiàn)[6]的方法，以蘆丁的濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出回歸方程。

樣品測定：取適量水提物浸膏配制成1 mg/mL的水溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法測定其吸光值，由回歸方程計算該樣品液中總黃酮的含量C，并由此計算出芫荽籽和成熟莖葉中的總黃酮含量。

1.3.3 體外抗氧化活性的研究

1.3.3.1 提取物對羥自由基的清除作用

采用改良的Smirnoff水楊酸法，實驗以抗壞血酸(VC)做對照，計算清除率。

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100。

注：A1為加樣品/VC，含H2O2；A2為加樣品/VC，不加H2O2；A0為不加樣品/VC，加H2O2。

1.3.3.2 提取物對DPPH自由基的清除作用

[2]，[7]方法，DPPH溶液濃度為75 μmol/L。實驗以抗壞血酸(VC)做對照，計算清除率。

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100。

注：A1為加樣品/VC；A2為只加入樣品/Vc；A0為不加樣品。

1.3.3.3 提取物還原能力測定

參考文獻(xiàn)[8]的方法，測定兩種提取物的還原力，實驗以抗壞血酸(VC)為陽性對照，結(jié)果以O(shè)D值的大小來表示還原能力。

1.3.4 體外降血糖活性的研究

1.3.4.1 抑制α-葡萄糖苷酶活性的研究

參考文獻(xiàn)[9]，配制0.4 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液、0.01 mol/L PNPG溶液和0.1 mol/L碳酸鈉溶液，備用。在96孔板中依次加入20 μL樣品溶液和40 μL α-葡萄糖苷酶溶液，于37 ℃恒溫箱中放置10 min，然后加入30 μL PNPG底物溶液，37 ℃溫度下反應(yīng)20 min后，加入100 μL Na2CO3溶液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在405 nm波長下測定吸光值。實驗以阿卡波糖為陽性對照，步驟同上，計算抑制率。

抑制率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100。

注：A1為加樣品；A2為加樣品，不加酶和底物；A0為不加樣品。

1.3.4.2 抑制α-葡萄糖苷酶動力學(xué)研究

根據(jù)文獻(xiàn)[10]，設(shè)置一系列底物濃度1.25，2.5，5，10 mmol/L。加入同一濃度抑制劑，在不同底物濃度條件下測定葡萄糖苷酶的活力，然后改變抑制劑的濃度，得到一系列不同底物濃度條件下的酶活力，實驗方法同1.3.4.1。根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法結(jié)果的特征分析，推斷提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制類型。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取物總黃酮含量

根據(jù)實驗方法1.3.2進(jìn)行測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

蘆丁濃度C和吸光值A(chǔ)的關(guān)系曲線的回歸方程為：A=7.9271C-0.0016，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998。根據(jù)實驗結(jié)果和回歸方程可計算出：芫荽籽水提物芫荽籽中總黃酮含量為4.4 mg/g，成熟芫荽莖葉中總黃酮含量為27.4 mg/g。

2.2 體外抗氧化活性的研究

2.2.1 提取物對羥自由基的清除作用

羥自由基(·OH)是造成組織細(xì)胞損傷的重要活性氧之一。通過測定對羥自由基清除的作用可以體現(xiàn)出抗氧化活性能力。

圖2 兩種水提物對羥自由基的清除作用

由圖2可知，芫荽籽水提物和成熟芫荽莖葉水提物對羥自由基均有較好的清除作用，在2～10 mg/mL濃度范圍內(nèi)清除自由基的能力隨著提取物的濃度增加而逐漸提高，10 mg/mL后略有下降。芫荽籽水提物和成熟芫荽莖葉水提物均在濃度為10 mg/mL時對羥自由基有最大清除率，分別為61.89%和32.42%，分別相當(dāng)于0.13 mg/mL和0.07 mg/mL VC溶液的清除率，在實驗濃度范圍內(nèi)，籽水提物對羥自由基的清除率明顯高于莖葉提取物(p<0.05)，但兩者均低于VC的清除能力。

2.2.2 提取物對DPPH自由基的清除作用

DPPH自由基清除實驗廣泛應(yīng)用于評價植物提取物的抗氧化能力。

圖3 兩種水提物對DPPH自由基的清除作用

由圖3可知，兩種提取物對DPPH自由基的清除能力均呈現(xiàn)出濃度依賴性，且莖葉提取物對DPPH的清除率高于籽提取物，兩種水提物對自由基的清除作用具有顯著差異(p<0.05)，其中芫荽籽提取液的EC50為2.75 mg/mL，莖葉提取液的EC50為1.83 mg/mL，均顯示出良好的清除作用，但均低于陽性對照VC(EC50=0.044 mg/mL)。

2.2.3 提取物還原能力測定

還原能力的測定是以普魯士藍(lán)[Fe4( Fe(CN)6)3]生成量作為指標(biāo)，由波長700 nm處吸光值變化反映還原力大小，吸光值愈高表示樣品的還原力愈強(qiáng)。

圖4 兩種水提物的還原能力

由圖4可知，與未添加抗氧化劑組相比，添加了提取物的實驗組的吸光值均明顯升高(p<0.05)。在實驗濃度范圍內(nèi)還原力大小均與兩種提取物的濃度呈現(xiàn)出濃度依賴性，且芫荽莖葉提取物的還原能力明顯高于籽提取物(p<0.05)，實驗最大濃度1.2 mg/mL的芫荽籽水提物和莖葉提取物的還原能力分別相當(dāng)于38，49 μg/mL的VC溶液的還原力。

2.3 體外降血糖活性的研究

2.3.1 抑制α-葡萄糖苷酶活性的研究

α-葡萄糖苷酶是一種糖苷水解酶，具有抑制作用靶點，可被作用于調(diào)節(jié)體內(nèi)糖代謝水平，目前，例如阿卡波糖等α-葡萄糖苷酶抑制劑已經(jīng)成為一種成熟的治療糖尿病的藥物。

圖5 兩種水提物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

由圖5可知，芫荽籽水提物和芫荽莖葉水提物均對α-葡萄糖苷酶有抑制作用，在實驗濃度范圍內(nèi)，抑制效果均會隨著濃度增高而增強(qiáng)，兩種提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用效果具有顯著差異(p<0.05)，成熟芫荽莖葉提取物的抑制效果優(yōu)于芫荽籽提取物的作用效果，兩者的EC50分別為4.6，6.8 mg/mL。陽性藥物阿卡波糖的EC50為28.1 mg/mL，由此可見，芫荽提取物明顯表現(xiàn)出更高的抑制效果，具有作為潛在的α-葡萄糖苷酶抑制劑的開發(fā)前景。

2.3.2 抑制α-葡萄糖苷酶動力學(xué)研究

圖6 成熟芫荽莖葉水提物對α-葡萄糖苷酶作用的雙倒數(shù)動力學(xué)曲線

圖7 芫荽籽水提物對α-葡萄糖苷酶作用的雙倒數(shù)動力學(xué)曲線

由圖6和圖7可知，在兩種不同提取物抑制反應(yīng)實驗中，加入不同濃度抑制劑后，三條作用曲線相交于x軸，即酶的米氏常數(shù)Km保持不變，由此可以推斷出，芫荽籽水提物和成熟芫荽莖葉水提物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用類型均屬于非競爭性抑制。

3 討論

芫荽作為一種藥食兩用的香辛植物，一直受到國內(nèi)外科研人員的廣泛關(guān)注。已有文獻(xiàn)中對芫荽極性溶劑提取物研究的報道居多，例如陳志紅等用乙醇作為提取劑測定了新鮮芫荽植株總黃酮含量(8.493 mg/g)、清除羥自由基(IC50=122.331 mg/L)和O2-(IC50=71.535 mg/L)的能力；韓瀠儀等[11]研究發(fā)現(xiàn)芫荽乙醇提取物具有對DNA和蛋白質(zhì)兩種大分子氧化損傷的保護(hù)活性，最小保護(hù)質(zhì)量濃度分別是4.0，125.0 μg/mL；李鋒等[12]比較了芫荽籽不同溶劑粗提物的體外抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)95%乙醇提取物具有較好的清除H2O2和羥自由基的能力；Mojtaba等[13]評價了芫荽的體內(nèi)抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)乙醇提取物對大鼠神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用。然而芫荽作為常見的蔬菜，有關(guān)其水相提取物的研究報道略少，因而本實驗主要研究了芫荽水提物的生物活性，包括清除自由基能力和抑制α-葡萄糖苷酶的活性。由實驗結(jié)果可知，成熟芫荽莖葉和芫荽籽中的總黃酮含量分別為27.4，4.4 mg/g，且兩種水提物在不同抗氧化體系中均具有良好的效果，雖然與極性溶劑提取物相比抗氧化能力較弱，但水提物制備方便、安全可食，依舊具有潛在的開發(fā)為天然抗氧化劑的價值。

芫荽中不僅含有黃酮類化合物，據(jù)報道還含有多種酚酸成分[14]，多酚類化合物不僅具有良好的抗氧化效果，同時也具有降血糖的效果[15]。目前有關(guān)芫荽降血糖的報道以外文文獻(xiàn)較多[16,17]，國內(nèi)有關(guān)報道甚少。經(jīng)本實驗研究發(fā)現(xiàn)，芫荽籽水提物(EC50=4.6 mg/mL)和成熟莖葉水提物(EC50=6.8 mg/mL)在較低濃度條件下對α-葡萄糖苷酶就能表現(xiàn)出較好的抑制效果，比陽性對照阿卡波糖作用效果更好，表現(xiàn)為非競爭性抑制。目前上市應(yīng)用的α-葡萄糖苷酶抑制劑有三類：阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇，雖然這類抑制劑具有突出的降血糖效果，但是通常也會伴隨一定的胃腸道方面的副作用[18]，而天然α-葡萄糖苷酶抑制劑具有更安全、易獲取的優(yōu)勢，因而越來越多的研究人員嘗試從天然植物中篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑。例如，張鐘等[19]從荔枝中分離出多糖成分，發(fā)現(xiàn)在80 mg/mL條件下具有最佳抑制效果。高小平等[20]從24種中藥材中篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑，發(fā)現(xiàn)大黃、山茱萸、赤芍、五倍子這4種提取物具有良好的抑制效果。本實驗為進(jìn)一步更全面地研究芫荽提供了基礎(chǔ)，其水提物在天然抗氧化劑和天然α-葡萄糖苷酶抑制劑方面具有潛在的開發(fā)應(yīng)用前景。

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