翁思穎柴可夫

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 浙江 杭州 310053

2 浙江省寧波市中醫(yī)院 浙江 寧波 315000

糖尿病腎病(DN)是一種嚴(yán)重的糖尿病微血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致終末期腎病的重要原因之一。高糖所致的慢性炎癥可引發(fā)腎間質(zhì)纖維化，是DN早期腎損傷病理改變之一。在其纖維化過程中，可出現(xiàn)上皮細(xì)胞標(biāo)志E-鈣黏蛋白(E-Cadherin)丟失、間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)增加[1-2]。本團(tuán)隊(duì)前期研究[3]運(yùn)用益氣養(yǎng)陰活血湯治療DN大鼠，發(fā)現(xiàn)該方可下調(diào)大鼠腎組織NF-κB及MCP-1表達(dá)。為進(jìn)一步探討其保護(hù)腎臟的作用機(jī)制，本研究建立DN大鼠模型，以觀察益氣養(yǎng)陰活血湯對(duì)DN大鼠腎組織TNF-α及TGF-β1、α-SMA、E-Cadherin表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：8周齡雄性SD大鼠54只，SPF級(jí)，體重220～240g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按3R原則給予人道關(guān)懷，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)通過。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物：益氣養(yǎng)陰活血湯組成：生黃芪、女貞子、葛根各30g，丹參20g，制大黃5g。全方藥材由浙江省中藥研究所制劑室提供，全部藥材粉碎后加5倍水煎煮1h/次，合并2次濾液，調(diào)整PH值至7，濃縮定容至生藥含量2g/ml，微孔濾膜過濾除菌，分裝后4℃保存。

1.3 主要試劑及儀器：總蛋白提取試劑盒購(gòu)于Thermo，一抗兔抗大鼠TNF-α抗體、TGF-β1抗體、α-SMA抗體、E-Cadherin抗體均購(gòu)于Abcam，二抗羊大鼠IgG抗體購(gòu)于Thermo，脫水機(jī)(Thermo)，石蠟切片機(jī)、染色機(jī)、封片機(jī)(LEICA)，光鏡(OlymPus)。

1.4 造模與分組方法：參照文獻(xiàn)[4]建立DN大鼠模型，選取46只大鼠為造模組，禁食不禁水12h后，一次性腹腔注射1%鏈脲佐菌素(STZ)溶液45mg/kg。選8只正常大鼠設(shè)正常對(duì)照組(NC)，腹腔注射等量檸檬酸鈉緩沖液。兩組均予普通飼料喂養(yǎng)2周。2周后造模組大鼠禁食不禁水10h，篩選24只空腹血糖值在22±8mmol/L和尿總蛋白排泄率在50μg/min以上的大鼠為DN模型大鼠，隨機(jī)分為3組，即模型對(duì)照組(MC)、益氣養(yǎng)陰活血湯低劑量組(10g/kg，TD-lo)、益氣養(yǎng)陰活血湯高劑量組(30g/kg，TD-hi)。模型對(duì)照組和正常對(duì)照組灌服10ml/kg/d生理鹽水，余組灌服規(guī)定濃度中藥，連續(xù)灌胃8周。

1.5 標(biāo)本采集方法：每2周以血糖試紙測(cè)大鼠尾靜脈空腹血糖（FBG）。給藥結(jié)束后，大鼠禁食不禁水12h，取晨尿50μl留作尿液樣本。大鼠心臟取血4ml后處死，剪開腹腔后快速切除雙腎，去除腎包膜并沖凈，將腎組織放入10%福爾馬林液固定，制備切片，擬行蘇木素伊紅(HE)及Masson染色及免疫組化檢測(cè)。

1.6 一般指標(biāo)測(cè)定：生化法測(cè)大鼠血清肌酐(Scr)、血清尿素氮(SUN)水平(羅氏生化儀)，ELISA法測(cè)尿液N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)活性。

1.7 HE染色及Masson染色：腎組織10%甲醛固定，常規(guī)酒精脫水、石蠟包埋、切片后，取部分行HE染色，光鏡下觀察腎組織病理改變情況。另取部分以鐵蘇木素及麗春紅酸性品紅染液行Masson染色，光鏡下觀察腎組織纖維化程度。光鏡下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不重疊視野，Image.Pro Plus6.0分析系統(tǒng)測(cè)定膠原纖維藍(lán)染區(qū)面積，以該區(qū)域占選定區(qū)域面積(=視野面積-空白面積)百分比來評(píng)定腎間質(zhì)纖維化程度。

1.8 免疫組化法檢測(cè)：大鼠腎臟切開后，腎組織經(jīng)10%甲醛固定，蒸餾水沖洗后常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟，并水化、高壓熱修復(fù)抗原，以3%H2O2封閉過氧化酶，加入一抗兔抗大鼠TNF-α多克隆抗體(PBS 1：100倍稀釋)、TGF-β1多克隆抗體(PBS 1：100倍稀釋)、α-SMA多克隆抗體(PBS 1：150倍稀釋)、E-Cadherin多克隆抗體(PBS 1：150倍稀釋)，4℃孵育過夜后，室溫滴加二抗(用前PBS 1：1稀釋)，37℃孵育15min，PBS沖洗后加入DAB顯色(用前PBS 1：25稀釋)，蘇木素復(fù)染、脫水、封片。光鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽性。每張切片在高倍視野下隨機(jī)選取5個(gè)不同視野，以Image.Pro Plus6.0軟件對(duì)選擇陽性面積進(jìn)行測(cè)定計(jì)算，并取均值進(jìn)行分析，測(cè)定TNF-α、TGF-β1、α-SMA、E-Cadherin蛋白表達(dá)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS23.0軟件行數(shù)據(jù)分析，所有連續(xù)性變量以(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，若方差齊則采取LSD檢驗(yàn)，方差不齊則采用Dunnett’t3檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠FBG水平變化情況及給藥8周后大鼠Scr、SUN水平及尿NAG水平：對(duì)大鼠FBG監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，與NC組比較，MC組大鼠血FBG水平上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與MC組比較，TD-lo組及TD-hi組的血FBG水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。4組大鼠的血清Scr、SUN水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。另外，與NC組比較，MC組大鼠尿NAG水平上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與MC組比較，TD-lo組尿NAG水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，TD-hi組尿NAG水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。詳見圖1、2。

圖2 各組大鼠血清Scr、SUN、尿NAG水平變化情況(例數(shù)=8)

2.2 給藥8周后大鼠腎組織病理改變：HE染色：A圖(NC組)：腎小球、腎小管形態(tài)正常；B圖(MC組)：腎小球系膜細(xì)胞增生，腎小管基底膜增厚，間質(zhì)內(nèi)較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，散在小灶出血；C圖(TD-lo組)：腎小球、腎小管病變同B組，間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較B組少，可見部分小灶出血散布；D圖(TD-hi組)：腎小球系膜細(xì)胞增生、腎小管基底膜增厚不明顯，間質(zhì)內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯，偶見散在小灶出血。詳見圖3。

圖3 各組大鼠腎組織HE染色

Masson染色：A圖(NC組)：可見腎組織無異常；B圖(MC組)可見腎組織大量條索樣增生，與NC組比，腎間質(zhì)纖維化程度增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；C圖(TD-lo組)腎組織條索樣增生與MC組類似，纖維化程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；D圖(TD-hi組)腎組織中染色纖維條索樣增生較MC組減輕纖維化程度減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖4、圖5。

圖4 各組大鼠腎組織Masson染色

圖5 各組大鼠腎間質(zhì)膠原纖維藍(lán)染區(qū)面積/(視野面積-空白面積)百分比(例數(shù)=8)

2.3 免疫組化法測(cè)大鼠腎小管間質(zhì)TNF-α、TGF-β1、α-SMA、E-Cadherin的蛋白表達(dá)：與NC組比較，MC組大鼠TNF-α、TGF-β1、α-SMA蛋白表達(dá)水平均升高，ECadherin蛋白表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與MC組相比，TD-lo組TNF-α蛋白表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，TGF-β1、α-SMA、ECadherin蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，TD-hi組TNF-α、TGF-β1、α-SMA蛋白表達(dá)水平均下降，E-Cadherin蛋白表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。詳見圖6。

圖6 各組大鼠腎間質(zhì)TNF-α、TGF-β1、α-SMA、ECadherin蛋白表達(dá)(像素×103，例數(shù)=8)

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病最主要的慢性并發(fā)癥之一，2013年的一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查研究顯示DN患者10年發(fā)病率高達(dá)30.6%[5]。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為DN主要病理改變是腎小球硬化，而近期研究發(fā)現(xiàn)在早期DN腎損傷時(shí)即出現(xiàn)炎性因子升高并引發(fā)腎小管間質(zhì)纖維化，可不依賴腎小球病變直接導(dǎo)致腎功能惡化[6]。腎間質(zhì)纖維化形成與高血糖誘發(fā)的炎癥反應(yīng)有關(guān)，炎性因子可促使腎小管上皮細(xì)胞活化、淋巴細(xì)胞與巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)腎間質(zhì)，引發(fā)腎小管細(xì)胞過度凋亡，也可促使纖維化相關(guān)因子如轉(zhuǎn)分化因子TGF釋放，引起腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、上皮細(xì)胞標(biāo)志E-Cadherin丟失，導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化形成。另外細(xì)胞外基質(zhì)蛋白如α-SMA合成增多、降解減少，過度沉積于間質(zhì)也可引發(fā)間質(zhì)纖維化形成[7]。而早期腎小管損傷可出現(xiàn)尿液小分子量蛋白質(zhì)與NAG升高，可作為特征性標(biāo)志物評(píng)價(jià)腎小管損傷程度。

本研究結(jié)果顯示，各造模組大鼠均出現(xiàn)血糖升高，組間無明顯差異(P＞0.05)，MC組大鼠尿NAG水平較NC組升高(P＜0.05)，TD-hi組尿NAG水平較MC組下降(P＜0.05)，TD-lo組較MC組下降則無明顯差異(P＞0.05)。4組大鼠血清Scr、SUN水平無明顯差異(P＞0.05)。MC組大鼠腎組織切片HE染色可見腎單位受損、腎小管蛋白管型、腎間質(zhì)內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、散在小灶出血，腎間質(zhì)纖維化明顯。Masson染色可見腎間質(zhì)大量條索樣增生。TD-hi組大鼠腎組織病理切片中腎小管基底膜增厚、腎間質(zhì)內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及間質(zhì)纖維化明顯減輕，腎間質(zhì)條索樣增生明顯減少，TD-lo組大鼠腎組織中損傷與間質(zhì)纖維化減少不明顯。另外，免疫組化結(jié)果示MC組大鼠較NC組出現(xiàn)TNF-α、TGF-β1、α-SMA蛋白表達(dá)升高，E-Cadherin蛋白表達(dá)下降(P＜0.05)；較MC組，TD-lo組TNF-α蛋白表達(dá)下降(P＜0.05)，TGF-β1、α-SMA、E-Cadherin蛋白表達(dá)均無變化((P＞0.05)，TD-hi組TNF-α、TGF-β1、α-SMA蛋白表達(dá)均下降，ECadherin蛋白表達(dá)升高(P＜0.05)。

中醫(yī)學(xué)理論中糖尿病腎病是因消渴日久、耗傷陰津、煉津成瘀、入絡(luò)成痹引起。益氣養(yǎng)陰活血湯由黃芪、女貞子、葛根、丹參、制大黃組成。方中，生黃芪益氣扶正，葛根生津解熱，二者共為君藥，女貞子養(yǎng)陰滋腎，丹參活血涼血，酒制大黃祛瘀之力愈強(qiáng)，全方共奏益氣養(yǎng)陰、活血消癥、通利腎絡(luò)之效。本研究發(fā)現(xiàn)益氣養(yǎng)陰活血湯可下調(diào)DN大鼠腎組織TNF-α、TGF-β1、α-SMA表達(dá)，上調(diào)E-Cadherin表達(dá)，故筆者推斷益氣養(yǎng)陰活血湯可能通過以上機(jī)制減少高血糖引起的腎間質(zhì)纖維化，從而達(dá)到緩解高血糖所致腎損傷的目的。

[1]謝盛彬,王偉銘,陳楠.UUO模型大鼠腎間質(zhì)纖維化動(dòng)態(tài)進(jìn)展及α-SMA、TGF-β1和VDR表達(dá)變化[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2010,30(7)：752-757，796.

[2]張琳琪,呂雁,劉紅亮,等.益腎化瘀方對(duì)單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠腎組織中α-SMA、E-cadherin表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2014,29(6)：1966-1969.

[3]柴可夫,吳喜喜,杜月光.糖腎顆粒對(duì)糖尿病大鼠腎臟NF-κB和MCP-1表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2016,31(8)：3290-3293.

[4]陳澍,劉雪芳.鏈脲佐菌素誘導(dǎo)大鼠糖尿病腎病模型的建立[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2006,22（11）：1239-1240.

[5]Amin AP，Whaley-Connell AT，Li S，et a1.The synergistic relation shiP between estimated GFR and micro album in uria in Predicting long-term Progression to ESRDor death in Patients with diabetes：results from the Kidney Early Evaluation Program(KEEP)[J].American Journal of Kidney Diseases,2013,61(4)：S12-S23.

[6]羅俊輝,李瑛.炎癥細(xì)胞與糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2011,12(8)：742-745.

[7]陳騰鋒.腎臟纖維化機(jī)制的研究進(jìn)展[J].國(guó)際泌尿系統(tǒng)雜志,2011,31(3)：404-405.