高飛，尹紀來，李浩，王大平

(海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，海口570102)

慢加急性肝衰竭(Acute-on-chronic liver failure，ACLF)是一種急性肝臟損傷，臨床上主要表現(xiàn)為凝血機制障礙、高膽紅素血癥以及多臟器功能衰竭等。我國90%的ACLF由HBV引發(fā)，稱為HBV相關慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)。HBV-ACLF患者發(fā)病90天內(nèi)病死率高達43.1%，比其他慢性肝病高15倍，準確評估患者的預后有利于降低病死率[1～4]。終末期肝病模型(Model for end-stage liver disease，MELD)可對終末期肝病短期、中期病死率進行有效的預測，其評分越高，HBV-ACLF患者病情越重、預后越差。微小RNA(miRNA)是調(diào)節(jié)基因表達的重要因子[5]。研究[6～8]表明，miRNA-130a在機體抗感染過程中，具有抗病毒、抗細菌和加強細胞吞噬的作用。由于血清miRNA-130a檢測具有靈敏、準確、快速、簡便、重復性好等特點，被廣泛應用于多種疾病的診斷、判斷療效及預后[9]。本研究觀察了HBV-ACLF患者血清miRNA-130a水平變化及其與病情嚴重程度和預后的關系?，F(xiàn)將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2011年7月～2014年9月海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院收治的HBV-ACLF患者110例為病例組，男55例、女55例，年齡(45.30±9.70)歲，其中早期35例(早期組)、中期60例(中期組)、晚期15例(晚期組)，生存81例(生存組)、死亡29例(死亡組,截至2018年1月1日)。病例組MELD評分為(27.09±8.65)分。納入標準：符合亞太肝臟研究學會制定的HBV-ACLF診斷標準(2009年第3版)[10]。排除標準：患者有非酒精性脂肪肝、原發(fā)性硬化性膽管炎、自身免疫性肝炎、酒精性肝病、Wilson病或惡性腫瘤等疾病。選擇同期健康體檢者54例為對照組，其中男29例、女25例，年齡(45.5±9.80)歲。病例組、對照組性別、年齡具有可比性(P均>0.05)。所有受檢者清晨空腹抽取肘靜脈血10 mL，室溫靜置30 min，3 000 r/min離心10 min，分離血清備檢。

1.2 血清miRNA-130a檢測 采用mirVana miRNA分離試劑盒(Ambion公司)提取病例組及對照組血清總RNA，Nanodrop 2000分光光度計(Thermo Scientific公司)測量RNA的純度,參照GenBank數(shù)據(jù)獲取待測基因序列，采用Primer 5.0軟件，根據(jù)實時熒光定量PCR引物設計原則設計引物。miR-130a正向引物為5′-AGTCTATACAAGGGCAAGCTCTC-3′，反向引物為5′-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3′;內(nèi)參基因β-actin正向引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應體系：正向引物0.4μL、反向引物0.4μL、RNA模版0.6 μL、超級酶混合物0.2 μL、RT-qPCR緩沖液5 μL、去RNA水3.4 μL。93 ℃預變性5 min，40個循環(huán)(93 ℃ 40 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s)進行PCR擴增。用2-ΔΔCt表示血清miR-130a的相對表達量。

1.3 血清miRNA-130a的表達量與HBV-ACLF患者預后關系分析 對所有HBV-ACLF患者進行隨訪，隨訪截止日期為 2018年1月1日或患者死亡，隨訪內(nèi)容為治療效果、恢復情況、病情變化、不良預后結局(肝硬化、腹水、肝腎綜合癥、上消化道出血、糖尿病、肝性腦病、電解質(zhì)紊亂、死亡)發(fā)生情況等。以HBV-ACLF患者血清miRNA-130a相對表達量中位數(shù)為界，將110例HBV-ACLF患者分為miRNA-130a高表達組和低表達組，分析血清miRNA-130a的表達量與HBV-ACLF患者預后的關系。

2 結果

2.1 各組血清miRNA-130a相對表達量比較 病例組、對照組血清miRNA-130a相對表達量分別為9.54±4.76、1.65±0.56，兩者相比，P<0.05。HBV-ACLF早期組、中期組、晚期組血清miRNA-130a相對表達量分別為13.01±1.62、9.12±2.04、7.99±2.88，兩兩相比，P均<0.05。HBV-ACLF死亡組、生存組血清miRNA-130a相對表達量分別為7.87±2.76、10.43±4.20，兩者相比，P<0.05。

2.2 病例組患者血清miRNA-130a表達量與MELD評分的相關性 病例組患者血清miRNA-130a表達量與MELD評分呈負相關關系(r=-0.654，P<0.01)。

2.3 病例組血清miRNA-130a表達量與HBV-ACLF患者預后的關系 病例組患者中miRNA-130a低表達組68例、高表達組42例。出現(xiàn)肝硬化、腹水、肝腎綜合征、上消化道出血、糖尿病、肝性腦病、電解質(zhì)紊亂和死亡者miRNA-130a低表達組分別為24、22、17、19、21、16、32、21例，高表達組分別為3、5、4、3、5、3、3、8例，兩組相比，P均<0.01。

3 討論

動物及細胞學試驗[11]證明，miR-130a參與了由多種病因引起的肝損傷或肝衰竭的發(fā)病過程。miR-130a可能是大鼠肝臟熱缺血和再灌注損傷的潛在生物學標志物，在肝臟再灌注損傷后，升高的miR-130a與丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和乳酸脫氫酶呈正相關[12]。在對乙酰氨基酚誘導豬急性肝衰竭的試驗[13]中，miR-130a表達水平上升顯著，且與肌酐升高呈正相關。本研究結果顯示，病例組miRNA-130a表達水平顯著高于對照組，這與上述結果一致。

研究[14]表明，miRNA-130a可調(diào)控淋巴細胞的定向轉(zhuǎn)移和趨化性，并可激活淋巴細胞、內(nèi)皮細胞、中性粒細胞、上皮細胞的趨化因子受體。在大鼠肝衰竭試驗[15]中，miRNA-130a抑制淋巴細胞、巨噬細胞凋亡，并誘導淋巴細胞、巨噬細胞從脾臟向肝臟的轉(zhuǎn)移，參與炎癥反應。miRNA-130a還參與調(diào)節(jié)中性粒細胞的有絲分裂，降低有絲分裂停滯蛋白的表達，并可加強抗炎藥物定向攻擊病變細胞；miRNA-130a還能促進淋巴細胞與肝臟病變組織黏附結合，建立反應灶。這些研究結果提示，在肝衰竭的發(fā)病過程中，miRNA-130a高表達提示機體的免疫反應增強，可能會為肝衰竭患者帶來良好的預后。結合本研究結果，HBV-ACLF中期組、晚期組miRNA-130a相對表達量低于早期組，晚期組miRNA-130a相對表達量低于中期組，HBV-ACLF死亡組miRNA-130a相對表達量低于生存組，顯示隨著HBV-ACLF患者病情嚴重程度的增加，miRNA-130a相對表達量逐漸降低。

研究[16～18]表明，miRNA-130a提高肝衰竭患者預后與一系列調(diào)控機制有關：miRNA-130a能通過堿基互補配對與目標RNA的編碼區(qū)特異性結合，促進RNA的翻譯，促進淋巴細胞錨定融合血管內(nèi)壁，促進免疫細胞束縛病變靶細胞，而一些細胞免疫活性因子如MCP-1、TNF-a、IL-1、IL-8等與miRNA-130a表達正相關。相關性分析結果顯示，miRNA-130a與MELD呈負相關關系，這提示miRNA-130a表達量與HBV-ACLF患者病情嚴重程度和預后負相關。為驗證上述結論，我們以HBV-ACLF患者血清miRNA-130a相對表達量中位數(shù)為界，將HBV-ACLF患者分為miRNA-130a高表達組和低表達組，結果發(fā)現(xiàn)miRNA-130a低表達組HBV-ACLF患者肝硬化、腹水、肝腎綜合癥、上消化道出血、糖尿病、肝性腦病、電解質(zhì)紊亂、死亡發(fā)生率高于miRNA-130a高表達組HBV-ACLF患者，這證實了上述結論，同時也說明高表達的miRNA-130a能提高HBV-ACLF患者預后。

綜上所述，HBV-ACLF患者miRNA-130a相對表達量顯著升高，且隨著HBV-ACLF患者病情嚴重程度的增加，miRNA-130a表達量逐漸降低。高表達的miRNA-130a能提高HBV-ACLF患者預后。