俞鳳，胡龍華，蔣沁炆，鐘橋石，陳艷慧，方雪瑤

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院/江西省醫(yī)學(xué)檢驗重點實驗室，南昌330006)

大腸埃希菌是臨床最常見的條件致病菌，可引起血流、泌尿道、下呼吸道等多部位感染，在醫(yī)院分離常見細(xì)菌分布構(gòu)成中位列第一[1]。產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶是大腸埃希菌對β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥的主要原因。抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、組織滲透能力強(qiáng)和對β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定性好的碳青霉烯類抗生素，是治療此類細(xì)菌感染的首選用藥，國內(nèi)常用的碳青霉烯類抗生素有亞胺培南、美羅培南、帕尼培南、厄他培南、比阿培南、多尼培南等。隨著近年來碳青霉烯類抗生素的廣泛使用，產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的檢出率不斷出現(xiàn)，以前主要為非發(fā)酵菌的鮑曼不動桿菌及銅綠假單胞菌，近幾年腸桿菌科細(xì)菌對碳青霉烯類藥物耐藥性上升速度較快，已成為學(xué)者們關(guān)注的重點。中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(CHINET)2008年監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，對碳青霉烯類抗生素亞胺培南和美羅培南耐藥的大腸埃希菌分別為0.2%和0.3%[1]，2015年則分別達(dá)到1.4%和1.6%[2]。耐碳青霉烯類大腸埃希菌感染的患者常困擾著臨床醫(yī)生，了解耐碳青霉烯類大腸埃希菌的耐藥特點及耐藥機(jī)制是臨床的迫切需求。本研究對臨床分離到的3株耐碳青霉烯類抗生素大腸埃希菌及其接合子進(jìn)行了耐藥基因檢測和測序，對其可能的傳播機(jī)制進(jìn)行了探討?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株、儀器及試劑 南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院2016年1月～2017年3月臨床分離的耐碳青霉烯類抗生素腸桿菌科細(xì)菌共153株，其中3株為耐碳青霉烯類抗生素大腸埃希菌(分別分離自骨科、胃腸外科、腫瘤科的3例患者的膿液)，依據(jù)本研究機(jī)構(gòu)菌株庫的收集碼對其進(jìn)行編碼，分別為DC10、DC44、DC52(對常用16種抗生素的藥敏試驗結(jié)果顯示，DC10、DC44、DC52對亞胺培南的最低抑菌濃度均≥16 μg/mL，對替加環(huán)素全部敏感，對頭孢類及哌拉西林/他唑巴坦均不敏感，對喹諾酮類藥物均耐藥，對氨曲南均耐藥)。陰性參考菌大腸埃希菌ATCC25922、感受態(tài)菌耐疊氮鈉的大腸埃希菌J53為江西省醫(yī)學(xué)檢驗重點實驗室保存。Vitek2-compact全自動微生物分析儀、配套試劑以及藥敏E-test條購自法國生物梅里埃公司，PCR儀購自杭州朗基科學(xué)儀器有限公司，電泳儀購自Biorad公司，凝膠成像儀購自上海天能公司。PCR試劑、DNA Marker購自北京天根生化科技有限公司，PCR引物由杭州擎科生物工程有限公司合成。

1.2 DC10、DC44、DC52的耐藥基因檢測及測序 煮沸法提取DC10、DC44、DC52的DNA，分別選擇碳青霉烯類耐藥基因(blaKPC、blaVIM、blaGES、blaIMP、blaNDM、blaGIM、blaOXA-23/48等)、β-內(nèi)酰胺類耐藥基因(blaTEM、blaSHV、blaCTX-M)、喹諾酮類耐藥基因(qnrA/B/S)引物進(jìn)行擴(kuò)增，所用引物及序列參照文獻(xiàn)[3]。建立25 μL PCR反應(yīng)體系：正、反向引物各1 μL，DNA聚合酶12.5 μL，三蒸水補足至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，根據(jù)各自引物的不同確定相應(yīng)退火溫度，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)后，72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在含Gold viewI染料的1%瓊脂糖凝膠中150 v電泳20 min，用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄。出現(xiàn)目的條帶即為檢測基因陽性，陽性產(chǎn)物送杭州擎科生物股份有限公司進(jìn)行測序，結(jié)果經(jīng)美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)核酸序列比對，確定耐藥基因型別。

1.3 DC10、DC44、DC52與J53的接合及接合子菌種鑒定、藥敏試驗、耐藥基因檢測 供體菌為DC10、DC44、DC52，受體菌為耐疊氮鈉的大腸埃希菌J53，分別接種于血平板，35 ℃孵育過夜。挑取3～5個新鮮培養(yǎng)菌落接種至LB 培養(yǎng)基，37 ℃搖床4 h后，供體菌和受體菌分別以1:4比例混合至1 mL的LB培養(yǎng)基中，35 ℃孵育過夜。吸取過夜培養(yǎng)的混合菌懸液100 μL，接種于含美羅培南(2 μg/mL)和疊氮鈉(150 μg/mL)的M-H培養(yǎng)基上，以供體菌和受體菌為質(zhì)控菌，37 ℃孵育過夜，挑取M-H培養(yǎng)基上的單個菌落或菌膜，轉(zhuǎn)種至血平板，35 ℃孵育過夜。按“1.2”方法對接合子進(jìn)行菌種鑒定、藥敏試驗、耐藥基因檢測及測序。

1.4 DC10、DC44、DC52的多位點序列分型(MLST)和親緣性分析 采用PCR方法對DC10、DC44、DC52的7個管家基因(adk,fumc,gyrB,icd,mdh,purA和recA)進(jìn)行擴(kuò)增、測序，所用引物及反應(yīng)條件參照MLST網(wǎng)站(http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli)。測序結(jié)果經(jīng)該網(wǎng)站比對，確定菌株序列型別。采用eBURST軟件分析DC10、DC44、DC52的親緣性。

2 結(jié)果

2.1 DC10、DC44、DC52的耐藥基因及測序結(jié)果 DC10、DC44、DC52中blaNDM基因均陽性，其他碳青霉烯類耐藥基因、喹諾酮類耐藥基因檢測均陰性。經(jīng)測序確認(rèn)DC10、DC52均攜帶blaNDM-1基因，其中DC52同時攜帶blaTEM-1基因；DC44攜帶blaNDM-3基因，同時攜帶blaTEM-1基因和blaCTX-M-15基因。

2.2 DC10、DC44、DC52與J53的接合及接合子菌種、藥敏試驗、耐藥基因 DC10、DC44、DC52均與J53接合成功，接合子為大腸埃希菌。接合子除對替加環(huán)素、阿米卡星敏感外，對β-內(nèi)酰胺類和碳青霉烯類抗生素均耐藥。耐藥基因檢測及測序結(jié)果顯示，DC10、DC44、DC52與J53的接合子均含有與DC10、DC44、DC52相同的碳青霉烯類耐藥基因。

2.3 DC10、DC44、DC52的MLST和親緣性 DC10、DC44、DC52共分3個序列型(ST)，DC10為ST744、DC44為ST7219、DC52為ST167。eBURST軟件分析結(jié)果顯示，ST744和ST167同屬于CC10克隆群，ST7219屬于CC131克隆群。

3 討論

本研究共收集到3株耐碳青霉烯類大腸埃希菌，均為多重耐藥株，其藥敏結(jié)果較為相似，均對替加環(huán)素和阿米卡星敏感，其中對頭孢類、喹諾酮類及磺胺類抗生素表現(xiàn)出相同的抑菌濃度，對亞胺培南的最低抑菌濃度均達(dá)16 μg/mL。

新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶1(New Delhi metallo-β-lactamse-1，NDM-1)是革蘭陰性桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的重要機(jī)制，由blaNDM-1基因編碼，也稱blaNDM-1酶。blaNDM-1酶屬于NDM-1，其活性部位為金屬離子Zn2+，能水解除單環(huán)類外的其他β-內(nèi)酰胺類抗生素。blaNDM-1酶的活性部位可被乙二胺四乙酸及巰基化合物等抑制，但不能被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑抑制。blaNDM-1基因多數(shù)位于質(zhì)粒上，且攜帶這種基因的質(zhì)粒有多種類型，如IncF、IncN和IncA/C等，這些質(zhì)粒多數(shù)具有寬宿主特性，可在不同菌屬間傳播。本研究通過接合實驗、PCR擴(kuò)增耐藥基因的檢測發(fā)現(xiàn)，DC10、DC44、DC52均與J53接合成功，接合子均含有與DC10、DC44、DC52相同的碳青霉烯基因，證明了此耐藥基因可以通過質(zhì)粒水平傳播。

自2008年首次檢測到分離出blaNDM-1酶的肺炎克雷伯菌[4]，全球各地相繼在大腸埃希菌、陰溝腸桿菌和銅綠假單胞菌等不同菌屬中分離出blaNDM-1酶[5]。blaNDM-1酶不能水解單環(huán)β-內(nèi)酰胺類抗生素如氨曲南，但由于質(zhì)粒上往往同時攜帶其他多種耐藥基因，如blaCTX-M、blaTEM和qnr等，常常會導(dǎo)致多重耐藥菌甚至泛耐藥菌的出現(xiàn)。本研究中3株耐碳青霉烯類抗生素大腸埃希菌對氨曲南均耐藥，這與文獻(xiàn)報道有超過 80%的blaNDM-1陽性菌株對氨曲南同時耐藥一致[6]。

MLST結(jié)果顯示3株耐碳青霉烯類抗生素大腸埃希菌分屬于3種不同的ST型，eBURST軟件分析DC10(ST744)與DC52(ST167)同屬于CC10克隆群，其祖先均為ST10，表明此兩株實驗菌存在相同起源性。DC44(ST7219)屬于CC131克隆群，其祖先為ST131。文獻(xiàn)報道[7]顯示，ST131在全世界范圍內(nèi)流行，并且發(fā)現(xiàn)CTX-M-15的O25b-ST131克隆菌株多數(shù)屬于種系發(fā)育B2群，為高毒力克隆群，而本實驗中攜帶blaNDM-3的DC44菌株為ST7219型，與ST131相比，僅管家基因icd發(fā)生了改變，這可能與文獻(xiàn)報道的高毒力機(jī)制有關(guān)。

目前blaNDM突變體已有17 種，2008年在瑞典首次報道產(chǎn)blaNDM-1酶的肺炎克雷伯菌[4]，2011年在英國發(fā)現(xiàn)產(chǎn)blaNDM-5酶的大腸埃希菌[8]，2014年在印度發(fā)現(xiàn)產(chǎn)blaNDM-4酶的大腸埃希菌[9]，2016年在中國發(fā)現(xiàn)產(chǎn)blaNDM-9酶的大腸埃希菌[10]，其余blaNDM亞型在全球各地也相繼報道[11]。blaNDM-3是blaNDM-1的變異體，在283位點發(fā)生T-C核苷酸突變，使其翻譯的氨基酸由天冬氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘於０罚覀兎治隹赡苁怯捎趦煞N氨基酸的特性接近，二者有較相似的酶活性[12]。有關(guān)blaNDM-3的報道較少，最早于日本1名患者的糞便中分離到1株大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)[13]。本研究報道的產(chǎn)blaNDM-3酶的大腸埃希菌在中國屬首例。

綜上所述，耐碳青霉烯類抗生素大腸埃希菌的耐藥基因為blaNDM基因，blaNDM能通過質(zhì)粒水平傳播。本研究發(fā)現(xiàn)1株產(chǎn)blaNDM-3酶的大腸埃希菌，目前國內(nèi)尚未見報道，我們首次在中國檢出1株產(chǎn)blaNDM-3酶的大腸埃希菌，并且該菌株同時攜帶blaTEM-1和blaCTX-M-15基因，耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，需高度關(guān)注。