劉榮霞，楊炳，余麗梅，趙春華

(1 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義 563003；2 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所)

卵巢早衰(POF)是指女性在40歲之前出現(xiàn)的以卵巢功能過早衰竭(如月經(jīng)稀發(fā)、閉經(jīng)、不孕等)為主要臨床表現(xiàn)的綜合征，血清中雌激素水平降低和促性腺激素水平升高為其特征。POF發(fā)病率在30～40歲的女性中占1%左右，且呈上升趨勢[1]。研究顯示，37%的POF由抗腫瘤治療等醫(yī)源性因素引起，特發(fā)性占25%，遺傳和免疫因素各占19%左右，不良生活、工作方式也為其誘因[2]。針對已知的發(fā)病原因和機制，POF目前主要的治療措施包括激素替代治療、促性腺激素釋放激素受體激動劑治療、冷凍組織(卵母細胞、卵巢組織、胚胎)移植、免疫調(diào)節(jié)、基因治療等[1,3]。然而，這些治療的效果主要以改善臨床癥狀為主，難以完全恢復(fù)卵巢正常功能，還存在明顯不良反應(yīng)，如激素替代治療增加致癌風(fēng)險。因此，尋找一種恢復(fù)卵巢功能治療手段顯得尤為重要。近年來，間充質(zhì)干細胞(MSC)療法被認為是一種修復(fù)受損組織、重建正常組織功能的替代治療手段，因其治療范圍廣泛和潛在的臨床應(yīng)用價值，逐漸成為研究熱點，也為包括POF在內(nèi)的各種難治性疾病帶來了新希望?，F(xiàn)就不同來源MSC治療POF作用及機制研究進展綜述如下。

1 MSC治療POF的可行性

MSC是來源于中胚層的成體干細胞，具有自我更新、多向分化潛能、低免疫原性、分泌多種細胞因子、改善組織局部微環(huán)境、促進血管和組織再生等特性[4]。也有研究顯示，MSC可通過上調(diào)Treg細胞、提高抗炎因子分泌、下調(diào)致炎因子水平，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[5]。特定條件下，MSC可以定向誘導(dǎo)分化為三個不同胚層的細胞如成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞、神經(jīng)細胞和肝細胞等[6]。因此，MSC被用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫疾病、糖尿病、肝硬化、肺纖維化和心肌梗死、退行性疾病(脊髓損傷、帕金森病、阿爾茨海默病)等。目前，已有十余種干細胞制劑用于治療移植物抗宿主病、急性心肌梗死、骨性關(guān)節(jié)炎等[6,7]，大量臨床研究也正在積極開展中。與其他種子細胞不同，MSC來源廣泛，存在于各種組織，如骨髓、臍帶、臍血、羊膜、胎盤、外周血、脂肪組織、牙組織、子宮內(nèi)膜等。盡管不同來源MSC存在一定生物特征與功能的差異，但MSC諸多的共同特性，使其成為臨床治療POF的理想制劑的候選者。

2 骨髓MSC治療POF的作用及機制

近年來，較多的研究報道了骨髓MSC治療POF的良好效果。將骨髓MSC以4×106個細胞/kg腹腔注射到環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的POF大鼠，或經(jīng)尾靜脈注射至順鉑誘導(dǎo)的POF大鼠體內(nèi)，骨髓MSC均可以很快遷移、歸巢到受損的卵巢，通過降低DNA損傷和減少卵泡凋亡來保護化療引起的性腺毒性，加速卵巢組織的修復(fù)。由于血管豐富程度或局部趨化因子或趨化因子受體分布的差異，移植的骨髓MSC主要分布在卵巢門和髓質(zhì)，少量分布于卵巢皮質(zhì)，卵泡、黃體中則未發(fā)現(xiàn)骨髓MSC，也未獲得骨髓MSC分化為卵泡和顆粒細胞的證據(jù)，提示骨髓MSC對卵泡發(fā)育和顆粒細胞的修復(fù)效果可能涉及MSCs的旁分泌效應(yīng)，或促血管生成與改變卵巢微環(huán)境，進而促進卵巢組織再生和功能恢復(fù)[8]。也有研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)磷酰胺引起卵巢組織中TNF-α水平升高，趨化骨髓MSC向受損的卵巢遷移，骨髓MSC則分泌IGF-1，其一方面促進卵巢血管再生，另一方面上調(diào)卵巢組織Bcl-2表達，阻止下游凋亡信號的激活，減少卵巢顆粒細胞凋亡，增強卵巢組織抗氧化應(yīng)激能力[9]。靜脈移植骨髓MSC至POF動物體內(nèi)，活體示蹤或免疫組化檢測，都僅見較少的骨髓MSC分布于卵巢，一定時間內(nèi)MSC大量的肺滯留或二次分布是否影響治療效果，是否存在非預(yù)期分化，產(chǎn)生非預(yù)期的不良影響，還不得而知。進而研究者在體外用miR-21基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染骨髓MSC，發(fā)現(xiàn)miR-21不僅可以增加骨髓MSC對化療的耐受，而且可以減少骨髓MSC的凋亡，增加骨髓MSC活力。轉(zhuǎn)染miR-21的骨髓MSC在體外與磷酰胺氮芥損傷的顆粒細胞共培養(yǎng)，可明顯減少顆粒細胞凋亡。原位注射轉(zhuǎn)染miR-21的骨髓MSC至POF大鼠卵巢組織，可見卵巢組織中miR-21表達上調(diào)，其靶向沉默下游基因10號染色體缺失的磷酸酶與張力蛋白同源基因(PTEN)和程序性細胞死亡基因4(PDCD4)，顆粒細胞凋亡明顯減少，POF大鼠卵巢結(jié)構(gòu)和功能得到了更好的恢復(fù)，顯示了一種增強型骨髓MSC對POF具有良好療效。也提示，miR-21修飾的骨髓MSC作用機制，與miR-21下調(diào)PTEN表達有關(guān)，即PTEN可能激活PI3K/Akt通路，誘導(dǎo)卵巢細胞生長、增殖，抑制細胞凋亡；同時miR-21抑制LPS信號通路，下調(diào)PDCD4，抑制下游IL-10和NF-κB表達，抑制細胞凋亡[10]。最新研究發(fā)現(xiàn)，骨髓MSC可以明顯提高生長期卵泡中抗苗勒管激素(AMH)、卵泡刺激素(FSH)、抑制素A和抑制素B的表達水平；上調(diào)卵巢組織卵泡發(fā)育相關(guān)基因Nano3、Nobox、Lhx8 mRNA水平，促進POF小鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)修復(fù)和卵泡發(fā)育[11]。雖然骨髓MSC在POF治療方面取得了一定的成果，但其臨床應(yīng)用還需臨床試驗進一步明確，骨髓MSC采集的有創(chuàng)性及年齡等因素影響骨髓MSC質(zhì)量，降低了骨髓MSC臨床應(yīng)用的可行性。

3 羊水干細胞(AFSC)治療POF的作用及機制

AFSC具有許多與MSC相似的生物學(xué)特性，將紅色熒光蛋白RFP標(biāo)記的CD44+/CD105+AFSC，原位注射到環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的POF小鼠，卵巢內(nèi)RFP熒光至少可觀察到3周，BrdUrd摻入法和免疫熒光染色則顯示，CD44+/CD105+AFSC在POF小鼠的卵巢組織中可保持長期增殖和自我更新，且具有正常的細胞周期。將AFSC移植到化療誘導(dǎo)POF的小鼠體內(nèi)，免疫熒光和免疫組化結(jié)果均顯示，人特異性細胞核抗原和卵泡刺激素受體(FSHR)主要表達在卵母細胞周圍，說明AFSC分化為顆粒細胞。AFSC移植后POF小鼠卵巢組織中AMH表達上調(diào)，后者可以通過抑制FSH，抑制過多的卵泡募集，控制原始卵泡形成，說明AFSC既可以直接分化為顆粒細胞促進卵泡的形成，也可以通過上調(diào)AMH表達，間接恢復(fù)POF小鼠卵巢儲備功能。但也有研究報道，AFSC移植入白消安聯(lián)合環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的POF小鼠卵巢，AFSC僅分布于卵巢間質(zhì)而不形成卵泡，既不表達生殖細胞標(biāo)志分子VASA，也不表達顆粒細胞標(biāo)志蛋白FSHR，且AFSC移植組和非移植組健康卵泡數(shù)、閉鎖卵泡數(shù)量沒有明顯的差異，表明AFSC主要是通過阻止卵泡閉鎖，增加健康卵泡數(shù)量而恢復(fù)卵巢的功能和POF小鼠生育能力[12]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，AFSC分泌的外泌體中富含miR-146a和miR-10a，其中miR-146a通過下調(diào)Irak1和traf632表達，miR-10a通過抑制Bim表達，下調(diào)Caspase-9表達，從而抑制顆粒細胞凋亡和預(yù)防卵泡閉鎖，恢復(fù)損傷卵巢的功能[13]。然而，AFSC需從超聲引導(dǎo)下獲取的羊水中分離，采集量、采集時間都十分受限，尤其是孕婦及胎兒存在風(fēng)險這些因素很大程度地上限制了AFSC的臨床應(yīng)用。

4 羊膜MSC(AMSC)治療POF的作用及機制

AMSC可以分泌大量的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ型膠原，這些膠原可以使AMSC在POF小鼠體內(nèi)存活更長的時間，提高AMSC的治療效果。AMSC也高表達轉(zhuǎn)錄因子OCT4和Nanog，后者通過JAK/STAT信號通路提高生長因子如骨保護蛋白、HGF、BDNF、TGF-β2、EGF和FGF-7，趨化因子如MCP-3、MCP-2、MIP-3-α、GCP-2、ENA-78和LIF的表達，促進顆粒細胞增殖，恢復(fù)損傷卵巢功能[14]。也有研究發(fā)現(xiàn)，與AMSC相比，低強度脈沖超聲波預(yù)處理的AMSC能更有效地恢復(fù)POF大鼠的卵巢功能，推測其機制可能為，低強度脈沖超聲波預(yù)處理的AMSC能更有效地上調(diào)IGF-1、HGF、VEGF、FGF2水平，下調(diào)促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達水平，并減少卵巢生殖干細胞的耗竭和改善生殖干細胞的微環(huán)境，促進生殖干細胞分化為原始卵泡，修復(fù)損傷的卵巢組織。AMSC也可以通過減少TNF-α和促凋亡因子Bax表達，或增加抗凋亡因子Bcl-2表達和Bcl-2/Bax比例，抑制顆粒細胞凋亡，促進卵泡生長，進而恢復(fù)卵巢功能[15]。本課題組此前的研究也證實AMSC對雙氧水局部損傷和順鉑所致POF均具有明顯治療效果，不但改善卵巢組織病理學(xué)變化，促進成熟卵泡發(fā)育，還可恢復(fù)小鼠血清雌激素與FSH水平及生育功能。

5 胎盤源性MSC(PMSC)治療POF的作用及機制

有研究報道，PMSC移植可以明顯改善透明帶糖蛋白3(ZP3)誘導(dǎo)的POF小鼠高促性腺激素、低雌激素血清水平，促進卵泡發(fā)育，抑制過多卵泡閉鎖和顆粒細胞凋亡，提高卵巢儲備能力。PMSC的作用機制可能涉及PMSC分泌多種細胞因子，減少竇前卵泡和囊狀卵泡中顆粒細胞凋亡，而顆粒細胞分泌的多種細胞因子則通過TGF-β/Smad信號通路，上調(diào)AMH的表達，后者抑制原始卵泡募集和卵泡發(fā)育，避免原始卵泡池過早耗竭，改善卵巢儲備能力，恢復(fù)POF卵巢功能[16]。另有研究認為，PMSC可上調(diào)POF小鼠血清中TGF-β水平，降低IFN-γ的水平，促進Treg細胞增殖，減少顆粒細胞凋亡，恢復(fù)卵巢功能。IFN-γ可以啟動卵泡閉鎖過程，刺激顆粒細胞中MHCⅠ和MHCⅡ的表達，導(dǎo)致卵泡破壞，而PMSC移植降低血清中IFN-γ水平，明顯阻斷上述過程的發(fā)生，減少次級卵泡和囊狀卵泡中顆粒細胞凋亡；PMSC可能分泌TGF-β，不僅在卵泡生成早期階段發(fā)揮刺激作用和調(diào)節(jié)原始卵泡池，而且刺激Treg細胞增殖。這可能為PMSC恢復(fù)POF的主要機制[17]。也有研究發(fā)現(xiàn)PMSC可以使Akt磷酸化，激活PI3K/Akt信號通路，減少POF小鼠卵巢中顆粒細胞凋亡和降低Th17/Tc17及Th17/Treg細胞的比例，從而改善卵巢功能[18]。最近發(fā)現(xiàn)，PMSC移植可以降低POF大鼠體內(nèi)解耦聯(lián)蛋白-2(UCP-2)、超氧化物歧化酶1(SOD1)和活性氧、8-羥基脫氧鳥苷水平，提高體內(nèi)線粒體功能，抑制氧化應(yīng)激，從而減少環(huán)磷酰胺對卵巢造成的損傷?？赡艿臋C制為，UCP-2通過解耦聯(lián)作用調(diào)控線粒體膜電位，進而改變線粒體ROS合成的量與速度，減輕氧化損傷，維持線粒體ATP的合成及線粒體的生物修復(fù)功能，最終保護卵巢線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能。

6 臍帶MSC(UCMSC)治療POF的作用及機制

靜脈注射UCMSC至環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的POF小鼠，能明顯減少顆粒細胞凋亡，增加卵泡數(shù)量，提高雌激素水平，有效恢復(fù)卵巢功能。一方面，UCMSC可能通過旁分泌機制，刺激顆粒細胞生長而發(fā)揮治療作用；UCMSC也可以上調(diào)卵巢干細胞功能蛋白如AKR1C18和Ly6a(Sca-1)、細胞循環(huán)控制蛋白CDKN2B水平，促進卵巢再生；另一方面UCMSC通過再次激活宿主的卵子，或間接調(diào)節(jié)卵巢微環(huán)境減少顆粒細胞凋亡恢復(fù)卵巢功能。UCMSC不但可減少環(huán)磷酰胺對卵巢組織的損傷，甚至還可修復(fù)環(huán)磷酰胺引起的成熟卵泡損傷，部分恢復(fù)大鼠卵巢內(nèi)分泌和生殖功能。作用機制主要為UCMSC分泌VEGF、IGF-1和HGF，抑制次級卵泡和囊狀卵泡凋亡，促進血管生成[19]；UCMSC也可能通過增加SOD2和過氧化氫酶表達，增強抗氧化和抗凋亡酶基因表達，減少細胞凋亡而減輕卵巢的氧化損傷[20]。UCMSC也可分泌多種生長因子，逆轉(zhuǎn)環(huán)磷酰胺阻斷的雌二醇和AMH對FSH的負反饋作用，阻止生長卵泡過度耗竭，最終改善卵泡的發(fā)育[21]。UCMSC分泌的外泌體可以融入順鉑損傷的卵巢顆粒細胞，通過上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達，下調(diào)促凋亡蛋白Bax表達，減少Caspase-3活化，增加DNA修復(fù)酶PARP表達，加速卵巢功能的恢復(fù)。外泌體所攜帶microRNA-24、microRNA-106a、microRNA-19b和microRNA-25可能也參與了抗卵巢顆粒細胞凋亡的效應(yīng)[22]。最新的研究證明，體外將卵巢與附著在膠原上的UCMSC共培養(yǎng)，能更有效的磷酸化原始卵泡中的FOXO3a和FOXO1，促進卵泡發(fā)育、成熟，也可在體內(nèi)刺激卵泡生長至排卵前階段，使體內(nèi)受損的卵巢功能和自然受孕能力得到明顯改善。與膠原上共培養(yǎng)，增加UCMSC AKT的T308位點磷酸化，AKT轉(zhuǎn)位至細胞核，磷酸化FOXO3a，最終激活原始卵泡，而磷酸化的FOXO1也可能以原始卵泡顆粒細胞為靶點，調(diào)節(jié)mTORC1活性，激活早期卵泡發(fā)育，促進顆粒細胞增殖、減少顆粒細胞凋亡。膠原共培養(yǎng)的UCMSC移植到POF患者體內(nèi)，也可以明顯增加UCMSC在患者卵巢的滯留時間，有利于UCMSC長期治療效應(yīng)的發(fā)揮[23]。

7 脂肪來源干細胞(ADSC)治療POF的作用及機制

ADSC也具有MSC的特征，且因其來源廣泛、取材容易、低損傷、易擴增等原因，逐漸受到研究者的廣泛關(guān)注。Angpt1表達上調(diào)與促進卵泡生長和血管生成有關(guān)，Zcchc11則通過上調(diào)IGF-1刺激顆粒細胞增殖，抑制細胞凋亡和促進卵泡腔形成。研究發(fā)現(xiàn)，ADSC移植治療環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的POF小鼠，可明顯上調(diào)Angpt1、Zcchc11和Onecut2基因表達，下調(diào)CXCR4表達，促進原始卵泡發(fā)育為成熟卵泡，但未見ADSC直接分化為卵泡細胞。ADSC同樣可通過分泌HGF、VEGF、TGF-β和PGF等細胞因子，減少顆粒細胞凋亡，增加卵泡數(shù)量，恢復(fù)卵巢功能。注射部位缺血、炎癥、細胞凋亡等因素都不利于ADSC在靶器官內(nèi)定植，且ADSC移植入體內(nèi)可迅速擴散到周圍的組織或器官甚至迅速死亡。因此，與單獨注射ADSC相比，將ADSC與膠原共培養(yǎng)后注射入POF大鼠體內(nèi)，能更好地恢復(fù)動情周期、雌二醇水平、卵泡發(fā)育及生育能力，這與膠原為ADSC提供適合遷移、定位、發(fā)揮功能的3D微環(huán)境并增加ADSC在卵巢的長期滯留有關(guān)，也可能為膠原能促進ADSC分泌VEGF、TGF-β1、FGF2和HGF，促進顆粒細胞增殖和血管生成所致[24]。

8 經(jīng)血來源的MSC(MenSC)治療POF的作用及機制

MenSC主要從女性經(jīng)血中提取，具有獲取無創(chuàng)、方便、可重復(fù)采集、倫理限制小等優(yōu)點。研究發(fā)現(xiàn)MenSC不僅表達CD29、CD44、CD73、CD90和CD105等MSC表面分子，還具有MSC的形態(tài)和干性特性，表達胚胎干細胞表面標(biāo)記SOX2、SSEA4、c-MyC和Nanog，比其他來源的成體干細胞更接近于胚胎干細胞。有研究報道，原位注射MenSC，POF小鼠的卵巢重量、血漿雌二醇水平和正常卵泡的數(shù)量均隨時間延長而增加，F(xiàn)SH水平則明顯降低，卵巢組織表達更高水平的AMH、抑制素α/β、FSHR及Ki67，且微陣列分析發(fā)現(xiàn)，MenSC移植后小鼠卵巢組織cDNA基因表達類型與人卵巢組織越來越相似，且MenSC可被誘導(dǎo)分化為卵巢顆粒樣細胞[25]。也有研究者認為，化療產(chǎn)生的炎癥信號刺激MenSC歸巢至損傷的卵巢，尤其是定位在卵丘細胞，可顯著改善卵巢微環(huán)境，刺激生殖干細胞池更新或刺激原始卵泡向成熟卵泡發(fā)育，從而恢復(fù)POF的卵巢功能[26]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，MenSC不但可以減少POF小鼠顆粒細胞凋亡，還可分泌IGF-1、VEGF、HGF、G-CSF，減輕卵巢間質(zhì)纖維化，促進卵巢組織血管再生改善卵巢微環(huán)境，進而增加卵泡細胞數(shù)量，恢復(fù)性激素正常水平[27]。

9 其他MSC治療POF的作用及機制

少量研究還報道了，皮膚源性的MSC也能改善化療誘導(dǎo)的POF，其機制與減少卵巢中TNF-α、TGF-β和IFN-γ等促炎因子表達水平，減輕卵巢炎癥反應(yīng)和損傷，改善局部微環(huán)境，促進卵子的生成有關(guān)[28]。也有研究顯示，臍血和絨毛膜源性的MSC同樣也可以恢復(fù)POF小鼠的卵巢功能[29,30]。

綜上所述，不同來源的MSC在治療POF方面有著相似療效，并可能通過相似或不同的機制發(fā)揮治療作用，這些都預(yù)示著MSC在POF治療方面具有誘人的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用前景，尤其在恢復(fù)POF者生育功能方面，甚至在POF所并發(fā)的女性衰老方面，都有著巨大的市場需求。因此，針對已知的POF致病原因或機制，全面而深入地評價MSC移植治療的安全性和有效性，尤其是對親代和子代長遠影響的評價，仍是亟待解決的關(guān)鍵問題。