楊飖，宋純，杜濤，韓俊毅

(同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院，上海 200123)

結(jié)直腸癌是消化道最為常見的惡性腫瘤之一。在我國，結(jié)直腸癌占惡性腫瘤病死率的第3～4位[1]。目前結(jié)直腸癌主要治療方法為手術(shù)加放化療，其中FOLFOX4方案化療在中晚期結(jié)直腸癌的綜合治療中有不可替代的作用。增強(qiáng)化療藥物的療效，對于改善結(jié)直腸癌患者的預(yù)后具有重要的意義。腫瘤免疫治療對于改善腸癌患者的預(yù)后有著顯著的臨床療效，是近來研究熱點。其中，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)發(fā)揮了重要作用，通過改變體內(nèi)Treg的表達(dá)量，有可能改善腸癌患者的預(yù)后。胸腺肽作為一種免疫增強(qiáng)劑被廣泛應(yīng)用于臨床治療，能非特異性刺激T淋巴細(xì)胞的增殖分化和成熟，調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群比例，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，在腫瘤治療過程中起著重要輔助作用[2-4]。本研究觀察了胸腺肽靜脈滴注輔助FOLFOX4方案化療對結(jié)腸癌根治術(shù)后患者外周血單個核細(xì)胞中Treg比例的影響，從而了解胸腺肽靜脈滴注輔助FOLFOX4方案化療對結(jié)腸癌根治術(shù)后患者免疫功能的影響及對腫瘤免疫的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年6月～2014年6月同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院接受結(jié)腸癌根治術(shù)(D3根治術(shù))治療并經(jīng)病理確診的結(jié)直腸癌患者55例，手術(shù)均順利完成，無吻合口漏、出血、腸梗阻等并發(fā)癥發(fā)生。患者術(shù)后TNM病理分期證實Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌患者(Ⅱ期結(jié)直腸癌患者含高危因素，包括組織學(xué)分化差、T4分期、血管淋巴管浸潤、腸梗阻或穿孔、腫瘤太近切緣、送檢淋巴結(jié)小于12枚)，術(shù)前未接受放化療及免疫治療，未使用類固醇和免疫抑制劑?；颊咧委熐熬炇鹬橥鈺?，治療方案報倫理委員會審批。55例患者中，男26例，女29例；年齡32～86歲；結(jié)腸癌24例，直腸癌31例；根據(jù)結(jié)直腸癌TNM分期，Ⅱ期25例，Ⅲ期30例；根據(jù)組織學(xué)分級，高分化3例，中分化39例，低分化13例；根據(jù)組織學(xué)類型，管狀腺癌38例，乳頭狀腺癌13例，黏液腺癌4例；根據(jù)腫瘤大體類型，隆起型6例，潰瘍型9例，潰瘍浸潤型40例；病程3～18個月，平均6.5個月。將觀察對象隨機(jī)分為T-FOLFOX4組(28例)、FOLFOX4組(27例)。

1.2 胸腺肽靜滴輔助FOLFOX4方案化療方法 所有入組對象在術(shù)后2周內(nèi)接受FOLFOX4方案化療。FOLFOX4方案：奧沙利鉑(注射用奧沙利鉑50 mg/瓶，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)85 mg/m2靜脈滴注2 h，第1天；亞葉酸鈣(50 mg/支，山西普德藥業(yè)有限公司)200 mg/m2靜滴2 h，第1、2天；氟尿嘧啶(浙江海正藥業(yè)股份有限公司)400 mg/m2靜注第1、2天；氟尿嘧啶1 200 mg/m2化療持續(xù)泵入46～48 h，每2周為1個周期，共12個周期。T-FOLFOX4組在化療基礎(chǔ)上加用胸腺肽(湖南五洲通藥業(yè)有限責(zé)任公司)200 mg靜脈滴注，第1～5天。

1.3 外周血單個核細(xì)胞中Treg比例測算 術(shù)后化療前、術(shù)后6個月(術(shù)后化療12個周期)、術(shù)后12個月(化療結(jié)束6個月)清晨空腹抽取兩組靜脈血2 mL，EDTA抗凝。吸管加入等體積2 mL的生理鹽水，使血液等倍稀釋。管中充分混勻。另取試管，加入2 mL淋巴細(xì)胞分離液(上海生工公司)，離心管傾斜，用一次性滴管將上述稀釋血4 mL在距分離液界面上1 cm處沿管壁緩慢加至分離液上面，稀釋血與分離液之比為2∶1。20 ℃恒溫1 500 r/min離心20 min。離心后，取出離心管，吸取中層單個核細(xì)胞，置入另一離心管中。加入生理鹽水吹打均勻后20 ℃恒溫1 800 r/min離心10 min，以去除殘余的分離液和雜質(zhì)細(xì)胞。再次生理鹽水洗滌細(xì)胞2次，吹打均勻，配平后每次1 500 r/min離心5 min后重懸，計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度。在每個流式上樣管中加入經(jīng)上述離心分離所得兩組結(jié)直腸癌患者單個核細(xì)胞懸液，每管細(xì)胞數(shù)約為1×106個，洗滌2遍。分別加入CD4、CD25單抗(美國BD公司)，混勻后4 ℃避光孵育30 min, 1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入1 mL破膜劑，4 ℃避光孵育12 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清。實驗組加入稀釋好的熒光標(biāo)記Foxp3抗體2.5 μL，陰性對照加入IgG對照抗體，4 ℃避光孵育30 min，洗滌，離心，加入500 μL PBS混勻，上機(jī)檢測。

1.4 外周血單個核細(xì)胞中Treg標(biāo)志物Foxp3、CD127 mRNA檢測 采用real-time PCR。TRIzol法分別從兩組離心分離所得單個核細(xì)胞中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Foxp3引物：上游5′-CATGCGACCCCCTTTCACCTAC-3′，下游5′-TCTCCACCCGCACAAAGCACTT-3′。CD127引物：上游5′-AAAGGATGAAAACAAATGGACGC-3′，下游5′-ATGCTGATGGTTAGTAAGATAGGAT-3′。內(nèi)參基因GAPDH引物：上游5′-TTGGCATCGTTGAGGGTCT-3′，下游5′-CAGTGGGAACACGGAAAGC-3′。反應(yīng)體系20 μL,反應(yīng)條件：95 ℃變性10 s，61 ℃ 10 s，72 ℃延伸45 s，共40個循環(huán)。每個測量組取3個復(fù)孔。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

入組55例對象隨訪12個月，其中49例患者療效可評價。FOLFOX4組1例患者失訪，T-FOLFOX4組2例及FOLFOX4組3例因出現(xiàn)奧沙利鉑神經(jīng)毒性反應(yīng)及骨髓抑制等化療毒副作用而退出研究。

2.1 兩組外周血單個核細(xì)胞中Treg比例比較 見表1。

表1 兩組外周血單個核細(xì)胞中Treg比例比較

注：與FOLFOX4組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 兩組外周血單個核細(xì)胞中Treg標(biāo)志物Foxp3、CD127 mRNA表達(dá)比較 見表2。

表2 兩組外周血單個核細(xì)胞中Treg標(biāo)志物Foxp3、

注：與FOLFOX4組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

結(jié)直腸癌是發(fā)達(dá)國家和地區(qū)導(dǎo)致人死亡的主要疾病之一，但目前治療效果尚不滿意，根治術(shù)后5年總體生存率為50%左右。化療在結(jié)直腸癌的綜合治療中起重要作用，尤其是中晚期腸癌患者。然而化療的臨床有效率有限，如何進(jìn)一步提高化療藥物的療效有著重要的臨床意義。近來研究[5,6]表明，CD4+CD25+Treg能影響機(jī)體抗腫瘤免疫功能，與自身免疫耐受和腫瘤免疫密切相關(guān)。Treg可以通過分泌TGF-β和IL-10介導(dǎo)細(xì)胞免疫抑制，能破壞細(xì)胞代謝、溶解細(xì)胞，并能影響腫瘤微環(huán)境[6,7]?；熕幬锏姆沁x擇性殺傷作用對于增殖活躍的Treg細(xì)胞也有殺傷作用，使化療后Treg細(xì)胞進(jìn)一步降低，從而也減少了它對腫瘤免疫的抑制。研究[8]發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者外周血中Treg細(xì)胞比例升高，與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。因此，如何調(diào)節(jié)CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量已成為抗腫瘤免疫治療的焦點。

胸腺肽已經(jīng)廣泛應(yīng)用于肺癌、乳腺癌、惡性黑色素瘤及腎癌等惡性腫瘤的治療中，國內(nèi)亦有應(yīng)用于結(jié)直腸癌的研究[9～11]?；A(chǔ)研究表明，胸腺肽可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的成熟，增加抗原或絲裂原激活后T細(xì)胞分泌的干擾素α、干擾素γ以及IL-2、IL-3等淋巴因子水平，同時增加T細(xì)胞表面淋巴因子受體水平，還可通過對CD4+T細(xì)胞的激活，增強(qiáng)異體和自體的人類混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，同時可調(diào)節(jié)胸腺細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞的分化及成熟及產(chǎn)生多種生物因子[12]。本研究結(jié)果顯示，在術(shù)后6個月、術(shù)后12個月T-FOLFOX4組患者外周血單個核細(xì)胞中CD4+CD25+Treg比例較FOLFOX4組顯著下降，表明胸腺肽靜脈滴注輔助FOLFOX4方案化療能顯著下調(diào)結(jié)腸癌根治術(shù)后患者外周血單個核細(xì)胞中Treg比例，從而可能進(jìn)一步抑制腫瘤免疫。叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子家族成員Foxp3是CD4+CD25+Treg細(xì)胞比較特異的形態(tài)和功能性指標(biāo)，被認(rèn)為是其最敏感的標(biāo)志物[13,14]。多數(shù)CD4+CD25+Treg細(xì)胞低表達(dá)CD127分子，并且CD127與Foxp3表達(dá)負(fù)相關(guān)[15]。因此，為進(jìn)一步研究胸腺肽輔助FOLFOX4對CD4+CD25+Treg的影響，我們檢測外周血單個核細(xì)胞中CD4+CD25+Treg的標(biāo)志物Foxp3 mRNA和CD127 mRNA的變化。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在術(shù)后6個月、術(shù)后12個月T-FOLFOX4組患者外周血單個核細(xì)胞中Foxp3、CD127 mRNA較FOLFOX4組表達(dá)降低。

綜上所述，胸腺肽靜脈滴注輔助FOLFOX4方案化療能夠明顯降低結(jié)直腸癌根治術(shù)后患者外周血單個核細(xì)胞中Treg的比例，從而使得化療后機(jī)體的細(xì)胞免疫功能得到很大的改善，以增強(qiáng)機(jī)體免疫監(jiān)視功能，可為抗腫瘤免疫提供一種新的治療途徑，但胸腺肽介導(dǎo)的抗腫瘤免疫作用的確切機(jī)制還有待于深入研究。