臧明泉，任建琳，靖琳，陶靈佳，桂奕文，閻國良，李寧

(上海中醫(yī)藥大學附屬市中醫(yī)醫(yī)院，上海200071)

外泌體是一種直徑在30～150 nm的囊性小泡，人體幾乎所有細胞都可以分泌外泌體。外泌體含多種功能性核酸和蛋白質，其物質轉運和信息傳遞的功能影響細胞生長分化[1]，在多種疾病特別是腫瘤研究中逐漸成為熱點[2,3]。腫瘤的生長涉及多種機制，包括血管新生、上皮間質轉化(EMT)、化療耐藥、免疫逃逸、基質降解等[4]，相關外泌體研究均涉及上述機制[5]。此前諸多研究報道外泌體具有促進腫瘤進展的作用，隨后外泌體抑制腫瘤生長和轉移的作用被證實。探討外泌體在腫瘤免疫調控、EMT、血管生成過程中的雙重作用，有助于揭示和理解外泌體在腫瘤發(fā)生、進展中的復雜作用?，F(xiàn)就相關研究進展綜述如下。

1 外泌體在腫瘤免疫調控中的作用機制

體內免疫調節(jié)對清除腫瘤細胞、抑制腫瘤生長意義顯著。多項研究表明外泌體參與了腫瘤細胞特異性識別、DC細胞抗原呈遞、T細胞殺傷、細胞自噬的過程。

1.1 外泌體促瘤性免疫調控 骨髓衍生抑制細胞的生長受到骨髓基質細胞外泌體的影響。骨髓衍生抑制細胞在融合骨髓基質細胞外泌體后，信號通路中的STAT3和STAT1被激活，抗凋亡蛋白Bcl-xL、Mcl-1表達上調，且骨髓衍生抑制細胞釋放NO增多，從而增強對T細胞的抑制[6]。卵巢癌源外泌體通過作用外周血中的淋巴細胞，調控其分泌的促炎因子、免疫刺激因子或免疫抑制因子水平，促進卵巢癌細胞免疫逃逸。Li等[7]將來源于卵巢癌和良性卵巢囊腫的外泌體分別添加到外周血淋巴細胞中，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)有26種基因表達增高以及2種基因表達下調，26種表達增高的基因主要有促炎因子、免疫刺激因子、免疫抑制因子(如CCL2/4/5/18、CXCL1/2/5/8/10/11、IL1B/2/6/12A、VEGFA)，而表達下調的2種基因為抗原提呈基因HLA-A和HLA-B，這種外泌體介導的基因表達調控極有可能是通過激活干擾素和NF-κB信號通路實現(xiàn)的；隨后研究者發(fā)現(xiàn)良性卵巢囊腫腹腔沖洗物相比卵巢癌患者惡性腹水來源的淋巴細胞核中P65和IRF5呈高表達。外泌體除了能夠調節(jié)上述免疫因子外，還可抑制免疫性細胞毒性反應。通常上皮性卵巢癌生長受免疫性細胞毒性作用的抑制，該抑制途徑包括NKG2D受體/配體通路和DNAM-1-PVR/nectin-2通路。有研究發(fā)現(xiàn)，上皮卵巢癌瘤體、上皮卵巢癌細胞系培養(yǎng)基上清液以及卵巢癌患者腹水來源的外泌體中NKG2D蛋白配體呈差異性表達，而DNAM-1配體含量較少；外周血單核細胞在獲取卵巢癌來源的外泌體后其介導的細胞毒性反應被抑制，這主要是通過外泌體NKG2D蛋白配體與接受細胞中的相應受體反應；下調外周血單核細胞中的NKG2D受體蛋白表達，減弱該蛋白介導的細胞毒性，將使單核細胞對卵巢上皮細胞的殺傷力受到抑制[8]。

1.2 外泌體抑瘤性免疫調控 由于外泌體內容和功能通常受其來源細胞的影響，通過大量分離來源于T細胞又具有抗原識別功能的外泌體作用于腫瘤細胞從而發(fā)揮直接免疫攻擊作用，這在腫瘤臨床治療相關研究中得到了廣泛關注[9]。腫瘤細胞來源的外泌體承載母細胞癌性抗原這一特性是利用疫苗靶向作用抗癌的基礎。Koyama等[10]將表達肺結核分歧桿菌的質粒導入黑色素瘤細胞株B16中，分離提純既含有B16細胞致癌性又含有肺分歧桿菌抗原(早期分泌性抗原靶-6)的外泌體，將其注入到B16細胞移植瘤小鼠的足底，發(fā)現(xiàn)可加強小鼠體內對瘤體細胞和早期分泌性抗原靶-6的免疫反應；若將外泌體注入到小鼠瘤體內，瘤體生長受到顯著抑制。在外泌體內含有足夠多致癌性抗原的條件下，即使外泌體內不含主要組織相容性復合體Ⅰ分子亦不影響B(tài)淋巴細胞誘導效應T細胞[11]。來源于拓泊替康作用后乳腺癌細胞的外泌體內含有特異性DNA，這種特異性DNA可通過作用于STING蛋白(一種有利于激活免疫反應的天然免疫接頭蛋白[12])介導樹突狀細胞激活，增強抗腫瘤免疫反應[13]。

2 外泌體在EMT中的作用機制

EMT是指上皮細胞完成具有侵襲和轉移等間質細胞特性的轉化，它是腫瘤細胞侵襲轉移和遠處播散的關鍵步驟之一[14]。外泌體通過調控Vimentin蛋白(EMT標志蛋白)影響受體細胞EMT而調節(jié)受體細胞侵襲轉移。有學者[15]從晚期肺癌患者血清和高侵襲性肺癌細胞及低侵襲性肺癌細胞中分別分離提取外泌體，發(fā)現(xiàn)前兩者源外泌體中Vimentin、N-cadherin蛋白高表達；將高侵襲性肺癌細胞株PC14HM及低侵襲性肺癌細胞株PC14源外泌體分別作用于正常支氣管上皮細胞后，發(fā)現(xiàn)PC14HM細胞源外泌體作用的支氣管上皮細胞的侵襲和遷移能力強于PC14細胞源外泌體作用的支氣管上皮細胞，并且前者的Vimentin、N-cadherin蛋白表達更高；研究人員還發(fā)現(xiàn)與正常人相比肺癌患者血漿中外泌體Vimentin蛋白水平顯著升高，并將外泌體對照組、外泌體Vimentin沉默組、siRNA陰性對照組的外泌體分別作用于人支氣管上皮細胞，發(fā)現(xiàn)細胞遷移能力在Vimentin沉默組、siRNA陰性對照組、外泌體對照組依次增高，明確了肺癌細胞分泌的外泌體能夠通過Vimentin蛋白促進EMT而促進侵襲轉移[15]。

腫瘤成纖維細胞釋放的外泌體被惡性細胞細胞攝取后，其EMT傾向顯著增強[16]。來自T細胞的外泌體對放療后人食管鱗狀癌細胞株TE13的增殖和侵襲轉移方面有著不一致的作用。TE13細胞在與T細胞來源外泌體共培養(yǎng)后，其增殖能力受到抑制，而侵襲遷移能力增強。研究人員提取受T細胞源外泌體影響后的TE13細胞中的蛋白，檢測后發(fā)現(xiàn)與促進EMT相關的β-catenin、NF-κB及snail蛋白表達上調，即T細胞來源的外泌體可能是通過上調β-catenin/NF-κB/snail信號通路蛋白表達而促進TE13細胞EMT進而導致侵襲轉移[17]。

3 外泌體在血管生成中的作用機制

血管生成是腫瘤增殖和侵襲轉移的重要環(huán)節(jié)。多種蛋白與血管生成密切相關，例如經(jīng)典的VEGFs、表皮生長因子受體家族(EGFRs)及內皮細胞分泌的血管抑制蛋白1(Vasohibin-1)[18,19]。近來與血管新生相關的外泌體及蛋白不斷涌現(xiàn)，如前列腺源外泌體中活性氧簇、慢性粒細胞白血病細胞株K562源外泌體與磷酸化Scr蛋白等，這對揭示腫瘤血管生成機制并尋找抗癌新靶點意義深遠[20,21]。

3.1 外泌體促進血管生成 現(xiàn)已證實膜聯(lián)蛋白(Annexin Ⅱ)在腫瘤細胞分泌的外泌體中高度表達。研究[22]表明，相對于正常細胞，乳腺癌細胞中Annexin Ⅱ高表達，且乳腺癌源外泌體中Annexin Ⅱ能夠促進tPA依賴的血管生成，這一作用得到體內體外實驗結果支持。HEF野生型人神經(jīng)母細胞瘤細胞源外泌體能夠增加有利于血管新生及腫瘤耐藥的蛋白分泌[23]?？沟蛲龌虻鞍譎AX-1在多種腫瘤細胞中表達，其有助于腫瘤細胞侵襲。一項研究[24]發(fā)現(xiàn)HAX-1在鼻咽癌細胞中高表達且與鼻咽癌患者的淋巴結轉移及預后密切相關；進一步研究表明鼻咽癌細胞源外泌體中HAX-1呈高水平，且HAX-1能夠增強人臍靜脈內皮細胞的血管新生能力，這表明鼻咽癌細胞源外泌體中的HAX-1促進血管新生可能是其有利于鼻咽癌生長轉移的因素。有學者[25]發(fā)現(xiàn)人膠質母細胞瘤株U251源外泌體促進人腦微血管內皮細胞血管生成的能力與其載有多種促血管生成蛋白密切相關，這些促血管生成蛋白主要包括明膠酶、纖溶酶原激活劑、VEGF、TGF-β及CXCR4趨化因子受體。另一項研究同樣支持腫瘤細胞源外泌體可促進血管生成。Hsu等[26]的研究揭示了缺氧條件下的肺癌細胞不僅產生更多外泌體，而且外泌體中miRNA-23a表達亦升高；缺氧肺癌細胞源外泌體中的miRNA-23a能夠作用于受體表皮細胞內的脯氨酰羥化酶1、2，導致細胞內缺氧誘導因子1(HIF-1)水平升高，有利于血管新生；此外，miRNA-23a尚能直接抑制緊密連接蛋白ZO-1表達，導致血管通透性增高、肺癌細胞跨血管遷移。

3.2 外泌體抑制血管生成 與上述作用相反，Pakravan等[27]發(fā)現(xiàn)間質干細胞源的外泌體能夠通過靶向mTOR/HIF-1α/VEGF信號通路而抑制乳腺癌細胞血管生成，并且該抑制作用與外泌體劑量成正比；發(fā)揮抑制作用的關鍵是間質干細胞源外泌體內的miRNA-100轉入乳腺癌細胞，如果miRNA-100被敲除，VEGF生成抑制的作用將被解除。Yang等[28]研究亦證明外泌體可抑制腫瘤血管新生，且靶點為VEFGR2。研究人員從受瘧原蟲感染小鼠血漿中分離純化外泌體，將這些外泌體注入肺癌細胞株Lewis荷瘤小鼠體內，與對照組相比，瘧原蟲感染源外泌體能顯著抑制瘤體生長；體外實驗中發(fā)現(xiàn)，瘧原蟲感染源外泌體與表皮細胞培養(yǎng)后能抑制細胞中VEGFR2的表達和表皮細胞遷移。該學者還發(fā)現(xiàn)瘧原蟲感染源外泌體內含有的miRNA-16/322/497/17是抑制血管生成的決定性因素。

隨著外泌體分離及鑒定等相關技術的發(fā)展，外泌體相關研究會在多種腫瘤防治層面得到體現(xiàn)，如外泌體對腫瘤細胞信號通路調控和關鍵蛋白表達的影響，特異性外泌體在腫瘤診斷、預后及治療評估中的應用，外泌體作為納米級抗腫瘤藥物載體的應用，以及外泌體作為疫苗用于免疫治療等。此外，在調節(jié)外泌體水平抗腫瘤的相關中醫(yī)藥研究中亦有許多抗腫瘤中藥單體涌現(xiàn)。中藥復方與外泌體相結合有利于發(fā)揮抗腫瘤多靶點優(yōu)勢，其縱向具體機制將會在后續(xù)研究中得到進一步揭示。值得關注的是外泌體具有雙重或多元效應，不同來源或載有不同核酸和蛋白的外泌體對同一類型腫瘤細胞有著雙重影響，甚至相同來源的外泌體對腫瘤細胞增殖和侵襲作用并不一致。外泌體在人體體液中廣泛存在，參與或介導腫瘤細胞生長、侵襲和遷移、耐藥、免疫逃逸、細胞凋亡等多個環(huán)節(jié)，深入研究外泌體并揭示其作用機制有利于推動外泌體在腫瘤早期診斷和臨床治療中的應用。

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