王青利，劉曉娥，肖延風(fēng)，李 敏，劉曉霞△

1.西安市中心醫(yī)院(西安710004)，2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院(西安710004)

世界衛(wèi)生組織(WHO)在1997年重新分類(lèi)了淋巴瘤，確立淋巴結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤為外周T和NK細(xì)胞淋巴瘤，其屬于一種惡性腫瘤，會(huì)進(jìn)行性毀損鼻腔及面中線并和EB病毒(EBV)感染相關(guān)?，F(xiàn)階段，臨床還沒(méi)有統(tǒng)一EBV感染、NK/T細(xì)胞淋巴瘤免疫表型等問(wèn)題[1-2]。NK/T細(xì)胞淋巴瘤在淋巴結(jié)外原發(fā)，具有生物學(xué)行為及免疫表型，形態(tài)學(xué)特殊。NK/T細(xì)胞淋巴瘤的瘤細(xì)胞能夠?qū)⒘Ｃ窧、TIA1等一些細(xì)胞毒性因子表達(dá)出來(lái)，通常情況下一方面對(duì)T細(xì)胞分化抗原進(jìn)行表達(dá)，另一方面對(duì)NK細(xì)胞相關(guān)抗原進(jìn)行表達(dá)，但是目前，臨床還沒(méi)有統(tǒng)一其確切的細(xì)胞屬性[3]。WHO在1997年充分分類(lèi)了淋巴瘤，在T細(xì)胞淋巴瘤中納入NK/T細(xì)胞淋巴瘤，認(rèn)為其屬于一種高度惡性腫瘤。本研究分析了EB病毒感染和NK/T細(xì)胞淋巴瘤免疫表型相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法

1 材 料 選取西安市中心醫(yī)院病理科2008年4月至2013年4月存檔的蠟塊，用4%甲醛固定標(biāo)本，石蠟包埋、H-E染色，經(jīng)免疫組織化學(xué)(CD20、CD45RO、CD56、CD3ε)和組織學(xué)形態(tài)分析，進(jìn)一步進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色[粒酶B、T細(xì)胞內(nèi)抗原1(TIA1)]，EBER1/2原位雜交檢測(cè)，明確診斷為NK/T細(xì)胞淋巴瘤。所有患兒均具有完整的臨床資料并將接受過(guò)放化療治療等患兒排除在外。其中男16例，女9例，年齡1～7歲，平均(4.2±0.4)歲。疾病部位：鼻腔19例，鼻咽3例，腭部2例，口咽1例。另選取鼻咽反應(yīng)性增生淋巴組織20例作為對(duì)照組，其中男13例，女7例，年齡2～7歲，平均(4.6±0.3)歲。兩組患者的年齡、性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

2 研究方法

2.1 免疫組織化學(xué)鏈霉素抗生物素-過(guò)氧化酶連接法檢測(cè)：福州邁新生物技術(shù)公司生產(chǎn)的CD20、CD45RO、CD56、粒酶B單克隆抗體、CD3ε多克隆抗體及SPS免疫組織化學(xué)試劑盒，DAKO基因有限公司生產(chǎn)的TIA1、LMP1單克隆抗體。切片，厚度為4 μm，常規(guī)脫蠟至水，用3% H2O2對(duì)內(nèi)源性過(guò)氧化物酶進(jìn)行10 min的阻斷，微波將修復(fù)抗原煮沸，10%正常山羊血清進(jìn)行10 min的封閉，將第1抗體加入其中，在4 ℃的溫度下過(guò)夜。將第2抗體加入，其標(biāo)記物為生物素，室溫下進(jìn)行30 min的孵育。將鏈酶卵白素加入，其標(biāo)記物為辣根酶，室溫下進(jìn)行10 min的孵育。DAB、蘇木精顯色、復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封固。將陽(yáng)性對(duì)照設(shè)定為試劑公司生產(chǎn)的陽(yáng)性片，將陰性對(duì)照設(shè)定為PBS，將一抗取代掉。

2.2 原位雜交檢測(cè)EBER1/2：應(yīng)用DAKO Y5200EBER-肽核酸(PNA)寡核苷酸探針EBER1/2及其配套試劑盒，其是一種小分子RNA，針對(duì)EBV編碼，標(biāo)記物為異硫氰酸熒光素(FITC)。切片，厚度為4 μm，常規(guī)脫蠟至水，室溫下進(jìn)行10 min的處理，在此過(guò)程中將3% H2O2充分利用起來(lái)，蛋白酶進(jìn)行20 min的消化，將EBER-PNA探針滴加其中，將Sigma公司生產(chǎn)的硅化蓋片蓋上。在55℃的烤箱、洗液中分別進(jìn)行2 h的孵育、25 min的振蕩洗滌，將標(biāo)記物為兔抗FITC/堿性磷酸酶(AP)的抗體滴加其中，室溫下進(jìn)行30 min的放置。進(jìn)行1 h的顯色，在此過(guò)程中將五溴-四氯-三吲哚磷酸脂/氮藍(lán)四唑(BCIP/NBT)充分利用起來(lái)。復(fù)染時(shí)間為核快紅時(shí)，在此過(guò)程中將甲基綠充分利用起來(lái)。常規(guī)脫水、透明、封固。分別應(yīng)用陽(yáng)性對(duì)照探針和陰性對(duì)照探針，位置為在T細(xì)胞淋巴瘤上，其已知EBV陽(yáng)性。

3 結(jié)果判斷 CD20、CD45RO、CD56蛋白，CD3ε、粒酶B、TIA1蛋白，EBER1/2，潛伏膜蛋白1(LMP1)的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)分別為細(xì)胞膜呈棕黃色染色，細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色顆粒狀染色，細(xì)胞核呈紫藍(lán)色、細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)不著色，細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜呈棕黃色著色[2]。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)數(shù)資料采用百分比表示，差異性檢驗(yàn)采用Fisher精確概率法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 組織學(xué)特點(diǎn) 25例患者均有一定程度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，凝固性壞死，多形性淋巴樣瘤細(xì)胞彌漫或散在分布，主要為中等細(xì)胞及大細(xì)胞，有血管中心性浸潤(rùn)12例。

2 免疫標(biāo)記 CD20陽(yáng)性0例，CD45RO陽(yáng)性25例(100.0%)，CD56陽(yáng)性21例(84.0%)，CD3ε陽(yáng)性25例(100.0%)，粒酶B陽(yáng)性22例(88.0%)，TIA1陽(yáng)性25例(100.0%)。

3 EBV感染 EBER1/2陽(yáng)性21例(84.0%)，LMP-1陽(yáng)性12例(48.0%)，EBER1/2、LMP-1均陽(yáng)性12例(48.0%)。20例反應(yīng)性增生淋巴組織EBER1/2、LMP-1陽(yáng)性均為0例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

4 相關(guān)性 EB病毒感染和NK/T細(xì)胞淋巴瘤免疫表型顯著相關(guān)(r=12.562，P=0.002)。

討 論

NK/T細(xì)胞淋巴瘤在淋巴結(jié)外原發(fā)，具有生物學(xué)行為及免疫表型，形態(tài)學(xué)特殊。NK/T細(xì)胞淋巴瘤的瘤細(xì)胞能夠?qū)⒘Ｃ窧、TIA1等一些細(xì)胞毒性因子表達(dá)出來(lái)，通常情況下一方面對(duì)T細(xì)胞分化抗原進(jìn)行表達(dá)，另一方面對(duì)NK細(xì)胞相關(guān)抗原進(jìn)行表達(dá)，但是目前，臨床還沒(méi)有統(tǒng)一其確切的細(xì)胞屬性。WHO在1997年充分分類(lèi)了淋巴瘤，在T細(xì)胞淋巴瘤中納入NK/T細(xì)胞淋巴瘤，認(rèn)為其屬于一種高度惡性腫瘤。本研究結(jié)果表明：25例NK/T細(xì)胞淋巴瘤CD45RO陽(yáng)性25例，CD56陽(yáng)性21例，CD3ε陽(yáng)性25例，粒酶B陽(yáng)性22例，TIA1陽(yáng)性25例，陽(yáng)性率分別為100.0%、84.0%、100.0%、88.0%、100.0%，說(shuō)明細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞或NK細(xì)胞是NK/T細(xì)胞淋巴瘤的瘤細(xì)胞的主要來(lái)源。越來(lái)越多的研究均表明[4-5]，絕大部分NK/T細(xì)胞淋巴瘤的瘤細(xì)胞能夠檢測(cè)出EBV基因組。分析TCRγ基因重排與免疫表型，結(jié)果顯示，NK/T細(xì)胞淋巴瘤是一組臨床病理類(lèi)型具有獨(dú)特性和EBV高度相關(guān)，可能從細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞起源，其屬于T及NK細(xì)胞系列，受EBV感染和轉(zhuǎn)化[6]。臨床普遍認(rèn)為[7]，和鼻咽癌及Hodgkin病的感染模式相比，NK/T細(xì)胞淋巴瘤中的EBV潛伏模式相同，將LMP-1等表達(dá)出來(lái)。

現(xiàn)階段臨床還沒(méi)有統(tǒng)一NK/T細(xì)胞淋巴瘤中EBV感染屬于伴隨現(xiàn)象還是屬于致病因素，還沒(méi)有弄清楚EBV的致瘤機(jī)制，可能有以下兩種途徑，即EBV對(duì)宿主細(xì)胞造成感染后，EBV基因向宿主基因組中整合，在該作用下，宿主基因組有突變發(fā)生，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生；EBV編碼產(chǎn)物將良好的前提條件提供給了腫瘤的發(fā)生，比如，LMP-1屬于一種致瘤性潛伏膜蛋白，編碼主體為EBV，能夠?qū)?xì)胞DNA損傷修復(fù)進(jìn)行抑制，同時(shí)還能夠?qū)I3K/Akt通路等激活，從而為腫瘤發(fā)生提供良好的前提條件[8]。EBV的易感部位為鼻腔/鼻咽部，研究表明[9-11]，EBV和NK/T細(xì)胞淋巴瘤的關(guān)系極為密切，EBER達(dá)到了80%～90%的陽(yáng)性率，不同種族之間具有相似的相關(guān)性。EBER的編碼主體也為EBV，其屬于一種功能性RNA，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)，在細(xì)胞核內(nèi)存在，每個(gè)細(xì)胞有107拷貝數(shù)，檢測(cè)具有較高的敏感度，能夠?qū)⒂行б罁?jù)提供給臨床對(duì)EBV感染的判斷[12-14]。EBER-1、EBER-2是兩種小分子RNA，轉(zhuǎn)錄主體為EBV，在EBV潛伏感染的細(xì)胞核中大量存在，在核內(nèi)EBER能夠結(jié)合La蛋白等兩種及以上的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，和核糖核蛋白相似，同時(shí)在穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)中存在，但是并不對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼，為EBV感染病毒病因?qū)W研究提供了有效依據(jù)[15]。本研究結(jié)果表明，EBER1/2陽(yáng)性21例，LMP-1陽(yáng)性12例，陽(yáng)性率分別為84.0%、48.0%，EBER1/2、LMP-1均陽(yáng)性12例。反應(yīng)性增生淋巴組織20例，EBER1/2陽(yáng)性0例，LMP-1陽(yáng)性0例，陽(yáng)性率均為0，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明在組織學(xué)診斷NK/T細(xì)胞淋巴瘤的過(guò)程中，LMP-1免疫組織化學(xué)檢測(cè)、EBER1/2原位雜交檢測(cè)可作為組織學(xué)診斷的輔助依據(jù)。

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