苗栓林,曹曉朋,胡麗芳

非小細胞肺癌是我國最常見、病死率最高的惡性腫瘤,其主要類型包括腺癌、鱗癌等小細胞肺癌，約占全部肺癌的80%[1]。由于非小細胞肺癌早期臨床特征不明顯，其檢出率和診斷率低下，患者確診時多為中晚期并伴轉(zhuǎn)移，其中肺癌骨轉(zhuǎn)移是其最常見的轉(zhuǎn)移類型之一，可導致常規(guī)手術(shù)治療、放化療效果欠佳，嚴重威脅患者的生命安全[2]。由于肺癌骨轉(zhuǎn)移患者自身條件普遍較差，故放化療治療相對受限[3]。細胞免疫治療作為新型治療技術(shù)，對多種惡性腫瘤療效滿意，本研究選擇自體細胞免疫治療(cytokine-induced killer, CIK)聯(lián)合序貫放化療治療肺癌骨轉(zhuǎn)移，探討其應(yīng)用效果與病理組織表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因突變狀態(tài)的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選擇2015年1月—2017年2月延安大學咸陽醫(yī)院收治的肺癌骨轉(zhuǎn)移91例，男51例，女40例；年齡(48.3±11.6)歲；病程(3.72±1.65)年；病理類型：腺癌48例，小細胞肺癌30例，鱗癌13例；轉(zhuǎn)移情況：肋骨轉(zhuǎn)移32例，胸椎轉(zhuǎn)移28例，腰椎轉(zhuǎn)移25例，骨盆轉(zhuǎn)移6例。納入標準：①根據(jù)臨床表現(xiàn)和肺癌組織病理活檢確診肺癌，同位素全身骨掃描確診肺癌骨轉(zhuǎn)移；②符合CIK治療、序貫化放療適應(yīng)證；③患者和家屬均具備獨立行事能力，了解治療風險，愿意配合治療研究。排除標準：①存在骨結(jié)核、骨折、骨惡性腫瘤等疾??；②存在精神心理疾病，難以配合治療。本研究已獲醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2治療及檢測方法

1.2.1序貫放化療治療方法：全部病例評估治療潛在風險、相關(guān)治療適應(yīng)證，給予序貫放化療治療，即NP化療方案：酒石酸長春瑞濱注射液(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，國藥準字：H20031337)30 mg/m2靜脈注射，第1 d、第8 d；注射用順鉑(山東鳳凰制藥股份有限公司，國藥準字：H20056422)40mg靜脈滴注，第1～3 d。4周為1個療程，連續(xù)化療3個療程?；熃Y(jié)束后，應(yīng)用放療直線加速器(美國瓦里安公司生產(chǎn))于化療第1 d給予放療，2 Gy/d，每周放療5次。每周10 Gy，總劑量為60 Gy。

1.2.2自體CIK細胞免疫治療方法：化療第1 d同時給予自體CIK細胞免疫治療，常規(guī)采集外周靜脈血100 ml，差速離心分離單個核細胞。放入無血清培養(yǎng)基并于37℃孵箱中培養(yǎng)2 h，PBS去除未貼壁細胞，繼續(xù)培養(yǎng)并加入購自齊魯制藥有限公司(國藥準字：201612086LAB)的注射用重組人白細胞介素-11注射液(rhIL-11)和購自廈門特寶生物工程股份有限公司(國藥準字：20141127、20160609)的注射用重組人粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)誘導單個核細胞CIK方向分化，加入白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等細胞因子誘導CIK成熟，經(jīng)形態(tài)學和分子生物標志物鑒定后持續(xù)擴大培養(yǎng)，回輸至患者體內(nèi)，隔日1次，共4次。

1.2.3免疫組化檢測EGFR基因突變情況：CT引導穿刺獲得肺癌組織，乙醇梯度脫水、包埋后石蠟切片、二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，去除內(nèi)源性過氧化物酶，pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液高溫高壓修復并冷卻至室溫，羊血清封閉后滴加EGFR抗del19和mut21突變抗體(Abcam Technology, Cambridge, UK)，稀釋比例1∶100，4℃孵育過夜；次日依次給予鏈霉素標記的羊抗兔二抗孵育15 min，鏈霉素標記的抗生物素孵育10 min，顯微鏡下DAB顯色1～3 min，流水沖洗10 min，蘇木素復染細胞核2 min，流水再次沖洗10 min返藍，最終經(jīng)乙醇梯度脫水和二甲苯透明后中性樹膠封片，顯微鏡下評估EGFR突變情況。免疫組化二抗試劑盒及DAB顯色液均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2.4基因測序法檢測EGFR基因突變情況：在用實時熒光定量核酸擴增檢測系統(tǒng)(qPCR)方法檢測同時，采用基因測序法檢測EGFR基因突變情況。肺癌組織標本經(jīng)10%福爾馬林固定、石蠟包埋后切片，直接采用基因測序法檢測EGFR基因是否存在基因缺失、突變情況，初次檢測結(jié)果采用引物再次進行反向測序驗證?；蚍治鰞x型號為ABI 3710Genetic Analyzer(美國Applied Biosystems公司)。EGFR測序法檢測相關(guān)突變的引物序列如下:del19上游引物：5'-GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCT-3'，下游引物5'-CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG-3'；mut21上游引物：5'-CTAACGTTCGCCAGCCATAAGTCC-3'，下游引物:5'-GCTGCGAGCTCACCCAGAATGTCTGG-3'。

1.3觀察指標及方法

1.3.1療效判定：根據(jù)中國肺癌骨轉(zhuǎn)移診療專家共識(2014版)[4]評估自體CIK細胞免疫治療聯(lián)合序貫化療的效果，即治療后3個月觀察患者癥狀改善程度，癌灶大小變化。治療有效評價標準為：癌癥所致疼痛、呼吸困難等癥狀緩解甚至消失，肺癌及轉(zhuǎn)移灶縮小，無明顯不良反應(yīng)和并發(fā)癥。

1.3.2EGFR基因突變評價標準：EGFR基因突變免疫組化檢測的陽性評價標準為細胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，評分包括陽性細胞比例評分和顯色強度評分兩項，二者之積即為該組織EGFR表達評分。每一份標本均由兩名病理科醫(yī)師經(jīng)盲法評估，取平均值作為表達水平進行評分。①陽性細胞評分：<5%，0分；5%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；>75%，4分。②染色強度評分：陰性0分；弱陽性1分；中等2分；強陽性3分。評分≤7分視為陰性，評分≥8分視為陽性[5]。

2 結(jié)果

2.1臨床療效 91例肺癌骨轉(zhuǎn)移經(jīng)治療后有效者70例，有效率達76.92%。

2.2免疫組化檢測結(jié)果 EGFR基因突變陽性為細胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。見圖1。治療有效組EGFR基因的del19和mut21突變檢測評分和陽性率均明顯高于治療無效組 (P<0.05)。見表1。

表1 兩組表皮生長因子受體基因突變差異評分和突變陽性率比較

2.3基因測序檢測結(jié)果 治療有效組EGFR基因的del19和mut21突變檢出率均明顯高于治療無效組 (P<0.05)。見表2。

表2 兩組表皮生長因子受體基因突變陽性率比較[例(%)]

圖1兩組免疫組化檢測表皮生長因子受體基因突變(SP×200)

A.有效組del19檢測結(jié)果;B.有效組mut21檢測結(jié)果;C.無效組del19檢測結(jié)果;D.無效組mut21檢測結(jié)果

3 討論

免疫治療是近年繼手術(shù)、放療、化療之后第4種具有治愈惡性腫瘤疾病希望的治療技術(shù)。因腫瘤細胞存在較強的免疫逃逸和免疫抑制功能，可有效擺脫正常免疫細胞的殺傷效應(yīng)[6]。因此，通過誘導和增強機體對腫瘤細胞的免疫力，經(jīng)免疫系統(tǒng)特異性殺傷腫瘤細胞，成為控制腫瘤生長，最終實現(xiàn)惡性腫瘤治愈[7]的新技術(shù)。目前，免疫治療常用的方法主要包括免疫細胞治療、免疫檢查點特征性抑制劑、針對性抗體、溶瘤病毒、特異性癌癥疫苗，其他免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑等，被應(yīng)用于不同腫瘤的基礎(chǔ)研究和臨床試驗性治療，取得了一定的療效[8]。

近年來，大量惡性腫瘤的免疫治療研究發(fā)展迅速，亦成為晚期非小細胞肺癌臨床治療的熱點[9]。本研究基于肺癌發(fā)病、發(fā)展的特點和原理，選擇自體CIK細胞免疫治療。CIK細胞是主要組織相容性復合物不受限的T淋巴免疫細胞，其分子表現(xiàn)為CD3+CD56+T陽性，具有極快的增殖和復制能力、廣譜抗瘤性和強殺瘤活性[10]。人外周血單個核細胞經(jīng)科學培養(yǎng)、針對性誘導分化成熟CIK細胞，重新回輸至患者體內(nèi)，可提高腫瘤細胞識別能力，并通過釋放大量分子靶向毒性顆粒作用于腫瘤細胞膜，裂解腫瘤細胞導致其死亡[11]。此外，與其他自體治療技術(shù)一致，具有免疫排斥發(fā)生率低、治療相對安全的優(yōu)勢[12]。

骨轉(zhuǎn)移是肺癌最常見的轉(zhuǎn)移部位之一，以肋骨、胸椎、腰椎、骨盆等多見，可致患者骨骼疼痛、功能癱瘓甚至死亡。針對肺癌骨轉(zhuǎn)移，常規(guī)放化療可大規(guī)模的殺滅和抑制肺癌細胞，但殘留腫瘤細胞成為日后復發(fā)、轉(zhuǎn)移的重要根源或唯一根源，也是手術(shù)、放化療治療失敗的根本原因[13-15]。故輔以CIK細胞免疫治療，可在細胞水平針對殘留的肺癌細胞繼續(xù)殺滅并抑制肺癌，極大地降低了復發(fā)率、轉(zhuǎn)移率，延長生存時間，并有效提高其生存質(zhì)量[16-17]。本研究對全部肺癌骨轉(zhuǎn)移給予自體CIK細胞免疫治療聯(lián)合序貫放化療，有效70例，有效率達76.92%，證實該治療臨床效果確切。

EGFR是ErbB家族的一種跨膜糖蛋白，作為細胞增殖和信號傳導受體，可刺激細胞生長失控、持續(xù)生長，最終發(fā)生癌變和遠處轉(zhuǎn)移，如骨轉(zhuǎn)移、腦轉(zhuǎn)移等[18-19]。目前，大量研究發(fā)現(xiàn)EGFR 基因突變狀態(tài)是篩選非小細胞肺癌患者進行酪氨酸激酶抑制劑( TKI) 治療最有價值的指標[20-23]。同時，檢測 19 外顯子 E746-A750 缺失和 21 外顯子 L858R 點突變的 EGFR 基因突變特異性抗體已成為準確、快速和經(jīng)濟的 EGFR 基因突變篩查方法用。本研究分別采用免疫組化和qPCR法檢測肺癌組織中EGFR基因突變情況，發(fā)現(xiàn)自體CIK細胞免疫治療聯(lián)合序貫放化療治療有效組EGFR基因突變檢出率顯著高于無效組，即del19和mut21檢出率均顯著高于無效組，提示EGFR基因突變的肺癌骨轉(zhuǎn)移，給予該方法治療具有更好的療效。

綜上所述，肺癌骨轉(zhuǎn)移進行自體CIK細胞免疫聯(lián)合序貫放化療，療效滿意，且EGFR組織基因突變狀態(tài)應(yīng)用該方法療效更好。

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