李金航，王愛春，周 濤，李 濤，蔡 宏，劉愛軍解放軍總醫(yī)院 病理科，北京 00853；軍事醫(yī)學科學院 儀器測試分析中心，北京 00850

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，全球每年診斷約23.9萬名卵巢癌患者，且每年15.2萬名患者死于卵巢癌[1]。大多數(shù)卵巢癌患者初次診斷即為晚期，Ⅲ期或Ⅳ期的患者5年生存率分別為28%和16%。化療結(jié)合腫瘤減滅術是治療卵巢癌的重要方式，順鉑和卡鉑是目前卵巢癌一線化療藥物，其通過進入細胞與DNA結(jié)合，形成加合物導致鏈內(nèi)和鏈間交聯(lián)，繼而使單鏈或雙鏈DNA斷裂，這種DNA損傷在無法修復的情況下可以導致細胞凋亡。鉑類藥物還可引起線粒體損傷，降低ATP酶活性導致細胞死亡。雖然卵巢癌被認為是一種化學敏感性腫瘤，80%對早期常規(guī)治療的反應率高，但晚期患者仍會發(fā)生腫瘤耐藥和復發(fā)，導致長期存活率較低[2]。CUEDC2(CUE domaincontaining protein 2)是一種由287個氨基酸殘基組成的多功能蛋白質(zhì)，廣泛存在于真核細胞中[3]，包含一個由40個氨基酸殘基組成的CUE結(jié)構域。研究證實CUEDC2與腫瘤細胞增殖相關，可以抑制腦膠質(zhì)瘤及肺腫瘤的增殖[4-5]，但會下調(diào)人乳腺癌細胞中孕激素受體(PR)、雌激素受體(ER)的泛素化水平、負調(diào)控雌激素和孕激素相關的信號通路[6-8]，還能下調(diào)p42MAPK、p44MAPK(ERK1/2)的磷酸化水平，即CUEDC2通過抑制MAPK活性抑制孕激素介導的細胞增殖。MAPK信號通路在細胞增殖、分化和存活的調(diào)節(jié)中發(fā)揮主要作用，該通路主要包括p38、ERK1/2和JNK通路[9]。MAPK通路的三級酶促級聯(lián)反應，即上游激活蛋白經(jīng)過激酶作用后，引起細胞內(nèi)級聯(lián)反應，從而調(diào)節(jié)細胞周期及對化療藥物的敏感性。研究發(fā)現(xiàn)，ERK1/2和JNK可以抑制細胞凋亡[10-11]，加快細胞周期進展，上調(diào)p38的磷酸化可以逆轉(zhuǎn)卵巢癌細胞系的耐藥性[12]。本研究通過檢測敲除CUEDC2后SKOV3細胞株對順鉑耐藥性的改變以及MAPK通路相關重要蛋白的改變，觀察CUEDC2影響順鉑對卵巢癌細胞增殖的抑制作用，從而探討卵巢癌耐藥的作用機制。

材料和方法

1 試劑與儀器 人卵巢漿液性乳頭狀癌細胞株SKOV3購自ATCC細胞庫。鼠抗人CUEDC2抗體受贈于軍事醫(yī)學科學院儀器測試分析中心，鼠抗人Tubulin、兔抗人P-p38 MAPK、兔抗人p38 MAPK、鼠抗人p-ERK、兔抗人ERK抗體購自Cell Signaling Technology(CST)公司。胎牛血清購自寶萊生物有限公司。Opti-MEM、DMEM購于中科邁晨(北京)科技有限公司。MTS檢測試劑盒購自Promega公司。iMax試劑盒購自 Invitrogen公司。兔、鼠二抗購自中杉金橋生物技術有限公司。CUEDC2干擾序列由實驗室化學合成(5’-CUCAGCGCCAGUUGCCUCAUCUUGG-3’)。順鉑購自齊魯制藥有限公司。

2 細胞培養(yǎng)及siRNA干擾 SKOV3細胞貼壁生長，置于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，常規(guī)2 ～ 3 d傳代。提前1 h將96孔板中培養(yǎng)基減半至40μl。分別配置相應體積的Opti-MEM與所制備的各干擾序列溶液 (si-CUEDC2 50 nmol/L，si-control 50 nmol/L)混合均勻，按iMax試劑使用說明取4μl，用100μl Opti-MEM稀釋，然后將上述100μl干擾序列溶液與該溶液等體積混合，混勻后靜置15 min。之后分別加入96孔板中，每孔10μl。37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)6 h后換液。Western blot鑒定。

3 Western blot檢測蛋白表達 取生長狀態(tài)良好的SKOV3細胞，消化后調(diào)整細胞濃度種于24孔板中，3×104/孔，每孔500μl。實驗分組：加藥組(順鉑 8μmol/L)，si-control組 (順 鉑 8μmol/L，sicontrol 50 nmol/L)，si-CUEDC2 組 (順鉑 8μmol/L，si-CUEDC2 50 nmol/L)，空白組。置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。72 h后，用M2緩沖液(Tris-HCL、NP-40、NaCl、EDTA、EGTA、PMSF、Cocktail、DTT、β-甘油磷酸、Na3VO4)經(jīng)裂解液法提取細胞蛋白，加樣于上層膠(5% SDS-PAGE)并在1×電泳緩沖液、80V電壓下濃縮，在下層膠(10%SDS-PAGE)、120V電壓中分離，然后在220 mA電流下經(jīng)2 h轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，然后一抗(CUEDC2、p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-ERK或ERK，1∶1 000)4℃孵育過夜。PBST洗膜3次，每次5 min，HRP連接的二抗(1∶5 000)孵育2 h。分別取出等量ECL試劑A、B液混勻，鋪于膜上，室溫孵育1 ～ 3 min。在暗室中曝光、顯影、定影。每項實驗重復3次。

4 MTS檢測SKOV3細胞增殖及IC50 取生長狀態(tài)良好SKOV3細胞，消化后調(diào)整細胞濃度于96孔板中，6 000/孔，每孔 100μl。si-control組：轉(zhuǎn)染 si-control(50 nmol/L)；si-CUEDC2組：轉(zhuǎn)染si-CUEDC2(50 nmol/L)。將順鉑加入細胞培養(yǎng)基中，終濃度分別為 0μmol/L、8μmol/L、16μmol/L、32μmol/L、64μmol/L，每一濃度分別設3個平行孔，置于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)72 h后應用MTS試劑盒檢測細胞增殖的變化。實驗過程：37℃水浴 10 min溶解 CellTiter 96? AQueous 單溶液試劑。在96孔板中，每孔100μl培養(yǎng)基加20μl CellTiter 96? AQueous單溶液試劑。在37℃，5% CO2的環(huán)境下孵育1 h，490 nm讀取吸光度值。應用SPSS軟件分別計算si-control組及si-CUEDC2組IC50。每項實驗重復3次。

5 錐蟲藍染色制作細胞增殖曲線 取生長狀態(tài)良好SKOV3細胞，消化后細胞種于12孔板中，7×104/孔，每孔1 ml，經(jīng)加藥或干擾處理，置于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，分別于24 h、48 h、72 h消化細胞，在顯微鏡下計數(shù)，用10×物鏡觀察計數(shù)板四角大方格中的細胞數(shù)，細胞壓中線時，只計左側(cè)和上方，不計右側(cè)和下方。計算細胞密度為(4大格細胞數(shù)之和/4)×104×2/原液體積(ml)。

6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析，事后檢驗采用LSD法及SNK法；Bliss法計算半數(shù)致死劑量(IC50)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 Western blot檢測敲低SKOV3細胞株中CUEDC2

SKOV3卵巢癌細胞株轉(zhuǎn)染si-control、si-CUEDC2 24 h，72 h后，與si-control組比較，si-CUEDC2組CUEDC2表達水平明顯降低(P＜0.05)，而sicontrol組與未轉(zhuǎn)染組對比，CUEDC2表達水平無明顯差異。見圖1。

圖 2 順鉑對si-control組與si-CUEDC2組 SKOV3細胞增殖的抑制作用(aP＜0.05, bP＜0.01)Fig. 2 Cisplatin could inhibit the proliferation of SKOV3 cell in sicontrol and si-CUEDC2 group (aP＜0.05, bP＜0.01)

圖 1 卵巢癌細胞SKOV3中轉(zhuǎn)染siRNA瞬時敲低CUEDC2水平后24 h CUEDC2蛋白表達情況(A)；轉(zhuǎn)染siRNA后72 h CUEDC2蛋白表達情況(B) [NT表示未轉(zhuǎn)染組，si-control表示轉(zhuǎn)染對照siRNA組，si-CUEDC2 (50 nmol/L)表示轉(zhuǎn)染si-CUEDC2 50 nmol/L組]Fig. 1 CUEDC2 was knocked down in SKOV3 cells using siRNA(10 nmol/L or 50 nmol/L) and analyzed by western blot at 24 h(A) and 72 h (B)

2 順鉑顯著抑制si-CUEDC2組SKOV3細胞增殖活性 si-control組和si-CUEDC2組中分別加入不同濃度的順鉑，孵育72 h后結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增加，順鉑對卵巢癌細胞生長的抑制作用逐漸增強(P＜0.05)；而與si-control組相比，順鉑對si-CUEDC2組細胞的抑制更顯著(P＜0.05)，見圖2。si-CUEDC2及si-control組的IC50分別為3.397μmol/L、10.203μmol/L。

3 SKOV3細胞株經(jīng)敲低CUEDC2后順鉑作用細胞計數(shù) SKOV3經(jīng)轉(zhuǎn)染si-control及si-CUEDC2后，加入順鉑8μmol/L分別孵育24 h、48 h、72 h時消化，經(jīng)錐蟲藍染色發(fā)現(xiàn)，隨時間延長，經(jīng)順鉑處理后，24 h及48 h si-control組及si-CUEDC2組細胞數(shù)均減少，兩組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；72 h時，si-control組與si-CUEDC2組細胞數(shù)有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。見圖3。

圖 3 錐蟲藍染色制作細胞增殖曲線 [aP＜0.05, vs si-CUEDC2(8μmol/L DDP)]Fig. 3 Cell proliferation curve by Trypan blue staining [aP＜0.05,vs si-CUEDC2 (8μmol/L DDP)]

圖 4 卵巢癌細胞SKOV3中磷酸化p38MAPK蛋白水平[DDP(8μmol/L)表示經(jīng)8μmol/L順鉑處理72 h， —表示只加入順鉑培養(yǎng)72 h， si-control表示轉(zhuǎn)染對照siRNA 50 nmol/L，si-CUEDC2表示轉(zhuǎn)染si-CUEDC2 50 nmol/L， NT表示未加順鉑培養(yǎng)72 h]Fig. 4 Level of Phosphorylatio-p38MAPK in SKOV3 cells Lane—: Cells were treated with 8μmol/L cisplatin (DDP); Lane si-control: Cells were treated with si-control (50 nmol/L) for 6 h, followed by treated with 8μmol/L cisplatin (DDP); Lane si-CUEDC2: Cells were treated with si-CUEDC2 (50 nmol/L)for 6 h, followed by treated with 8μmol/L cisplatin (DDP);Lane NT: Non-treatment

4 敲低CUEDC2對MAPK通路蛋白磷酸化水平的影響 在細胞瞬時干擾并加順鉑8μmol/L培養(yǎng)72 h之后收樣，與si-control組相比，si-CUEDC2組卵巢癌細胞p-p38 MAPK有明顯升高；而加藥組與空白組未見明顯差異，見圖4。我們同時也檢測了MAPK的其他通路，發(fā)現(xiàn)敲低CUEDC2后，卵巢癌細胞SKOV3中磷酸化ERK水平降低。見圖5。

圖 5 卵巢癌細胞SKOV3中磷酸化ERK蛋白水平[DDP(8μmol/L)表示經(jīng)8μmol/L順鉑處理72 h，—表示只加入順鉑培養(yǎng)72 h，si-control表示轉(zhuǎn)染對照siRNA 50 nmol/L， si-CUEDC2表示轉(zhuǎn)染si-CUEDC2 50 nmol/L， NT表示未加順鉑培養(yǎng)72 h]Fig. 5 Level of Phosphorylatio-ERK MAPK in SKOV3 cells. DDP(8μmol/L)：Cells were treated with 8μmol/L cisplatin for 72 h；Lane —: Cells were treated with 8μmol/L cisplatin;Lane si-control: Cells were treated with si-control (50 nmol/L)for 6 h, followed by treated with 8μmol/L cisplatin; Lane si-CUEDC2: Cells were treated with si-CUEDC2 (50 nmol/L)for 6 h, followed by treated with 8μmol/L cisplatin; Lane NT: Nonetreat

討 論

卵巢癌患者的治療方式主要是化療結(jié)合腫瘤減滅術，而目前順鉑是一線化療藥物，耐藥是導致患者長期生存率較低的主要原因。研究認為卵巢癌順鉑化療耐藥的分子機制主要與以下相關：1)順鉑結(jié)合到DNA前分子通路；2)直接涉及DNA-順鉑加合物形成機制；3)順鉑誘導DNA損傷的致死信號通路失活機制；4)影響與順鉑不存在明顯聯(lián)系的分子通路及其他機制[13]。其中MAPK信號通路的激活是導致卵巢癌耐藥重要原因，該通路主要包括p38、ERK1/2和JNK通路。

我們在實驗中發(fā)現(xiàn)CUEDC2可以抑制順鉑對卵巢癌細胞的細胞毒作用，敲低CUEDC2之后卵巢癌細胞對順鉑的敏感性增加。前期有研究發(fā)現(xiàn)CUEDC2可以導致乳腺癌細胞中ERK通路異常激活[8,14]。通過對卵巢癌中ERK通路蛋白的表達情況研究，發(fā)現(xiàn)經(jīng)順鉑作用，si-CUEDC2組的p-ERK水平較si-control組明顯降低，由此推測ERK通路可能也是CUEDC2引起卵巢癌耐藥的分子通路，與之前的研究結(jié)果一致[15]。

而MAPK信號通路中的p38MAPK與細胞生長、細胞周期及凋亡也密切相關，焦今文、Zhang等[16-17]的研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)p38的磷酸化可以逆轉(zhuǎn)卵巢癌細胞系的耐藥性。本研究發(fā)現(xiàn)在卵巢癌細胞經(jīng)瞬時轉(zhuǎn)染si-CUEDC2、順鉑作用72 h之后，si-CUEDC2組的p38磷酸化水平增高，說明CUEDC2可以降低p-p38的水平，與以往研究結(jié)果一致。然而CUEDC2如何與激酶相互作用，并影響信號通路的機制尚不清楚。

CUEDC2經(jīng)鑒定可以與100多種蛋白質(zhì)發(fā)生作用，其中包括G1期、G2/M期特異結(jié)合的蛋白質(zhì)[18]。但是細胞不經(jīng)順鉑處理，培養(yǎng)72 h之后，si-CUEDC2組較si-control組細胞數(shù)量僅有輕微減少，無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，因此我們推測CUEDC2可能作用于順鉑藥物引起細胞凋亡作用的位點，而不是直接與細胞周期蛋白相互作用，引起耐藥。

總之，敲低CUEDC2可以引起卵巢癌細胞系SKOV3細胞對順鉑的敏感性增加，并且si-CUEDC2組p38MAPK的磷酸化水平增加、ERK磷酸化水平降低。因此CUEDC2引起卵巢癌對順鉑的敏感性降低可能是通過抑制p38MAPK通路或者上調(diào)ERK通路引起的。我們的研究加深了卵巢癌化療耐藥機制探索，為搜尋靶向治療藥物、逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥提供新的思路和希望，而CUEDC2與MAPK通路相關蛋白作用機制有待進一步探討。

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