何 晨， 武秀知， 王 浩， 何秀苗，2

(1.廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院/廣西高校微生物與植物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530006 2.廣西民族大學(xué)/廣西多糖材料與改性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，廣西南寧 530006)

傳染性法氏囊病(IBD)是由雞傳染性法氏囊病毒(IBDV)引起的以危害青年雞為對(duì)象的烈性、高度接觸傳染性的病毒病[1]。IBDV屬于雙RNA病毒科禽雙RNA病毒屬，IBDV基因組由A、B等2個(gè)節(jié)段組成，A節(jié)段編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VP2、VP3，以及病毒的蛋白酶VP4、非結(jié)構(gòu)蛋白VP5，B節(jié)段編碼具有RNA依賴聚合酶活性的VP1蛋白[2]。VP3是IBDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，含有IBDV群特異性抗原決定簇，具有一定的免疫保護(hù)性。在病毒粒子中，VP3同自己以及VP2、VP1、病毒基因組相互作用，在病毒的致病性特別是病毒吸附細(xì)胞時(shí)具有重要作用，此外VP3還參與病毒的包裝，并具有穩(wěn)定RNA基因組的作用。Wang等研究發(fā)現(xiàn)，IBDV VP3羧基端一些氨基酸的改變將影響到病毒的致病性。為了解IBDV分離株中的VP3分子特征，本研究對(duì)獲得的1株IBDV分離株的VP3進(jìn)行分子特征分析，并對(duì)該蛋白進(jìn)行原核表達(dá)，以期為進(jìn)一步研究VP3的功能奠定基礎(chǔ)，同時(shí)分子特征分析也為進(jìn)一步了解流行株的變化趨勢(shì)、制定有效的IBD防控措施提供依據(jù)[3]。

1 材料與方法

1.1 材料

IBDV分離株JS7為筆者所在的課題組自行分離保存，大腸桿菌DH5α及BL21(DE3)、pET-28a表達(dá)載體為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存，pMD18-T、DL2000 Marker購(gòu)自大連寶生物有限公司，限制性核酸內(nèi)切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ等購(gòu)自Fermentas公司，Trizol RNA抽提試劑、2×TaqDNA mix、dNTPs、PCR產(chǎn)物純化試劑盒等購(gòu)自上海東洋仿生物科技有限公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和RNase抑制劑購(gòu)自Promege公司，瓊脂糖購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，膠回收試劑盒購(gòu)自天根生物制劑有限公司，其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 引物的設(shè)計(jì)

利用Primer5.0軟件根據(jù)已發(fā)表的IBDV毒株CEF94的A片段(序列號(hào)：AF194429)VP3序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物：上游Y1，5′-CCGGATCCCGCTTCAGAGTTCAAAGAGA-3′(BamH Ⅰ)，下游Y2，5′-CCAAGCTTCCTCACTCAAGGTCCTCATC-3′(Hind Ⅲ)，引物由深圳華大基因公司合成。

1.3 JS7-VP3基因的RT-PCR擴(kuò)增和克隆

將含有JS7毒株的雞法氏囊組織剪碎研磨后按質(zhì)量體積比1 g ∶5 mL的比例加入PBS(pH值7.4)，混勻，反復(fù)凍融3次， 12 000 r/min 離心3 min，取上清200 μL，加入1 mLTrizol振蕩混合均勻，按常規(guī)方法[4]提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄：取RNA 6 μL，加入隨機(jī)引物1 μL(25 pmol/μL)，混勻，70 ℃水浴作用10 min，-20 ℃冰浴作用5 min，加入5×RT Buffer 2 μL、dNTPs(2.5 m/moL)0.5 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL)0.5 μL，RNase抑制劑0.25 μL(200 U/μL)，總體積20 μL，42 ℃水浴作用1 h后，90 ℃滅活，即得cDNA。RT-PCR(體系)：2×Taqmix 12.5 μL，Y1和Y2引物各1 μL，cDNA模板4 μL，ddH2O 6.5 μL，共25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠鑒定陽(yáng)性后回收并直接進(jìn)行pMD18-T載體克隆，克隆方法按說明書進(jìn)行，重組載體的鑒定采用藍(lán)白斑、PCR和雙酶切法(即BamHⅠ和HindⅢ)進(jìn)行，陽(yáng)性克隆命名為pTVP3并送深圳華大基因股份有限公司測(cè)序。

1.4 序列分析

用Lasergene的Megalign軟件對(duì)序列進(jìn)行同源性比較分析，用MEGA5.0 軟件繪制遺傳進(jìn)化樹。參考毒株為經(jīng)典毒株為Cu-1wt、IM、Lukert、CU1M；致弱毒株為Gt、CEF94，疫苗株：B87；超強(qiáng)毒株為OKYM、UK661、HK46、BD3/99、Harbin-1、02015.1、Gx、HLJ-0504、SH95；血清Ⅱ型毒株OH。

1.5 JS7-VP3基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

測(cè)序正確的陽(yáng)性重組體pTVP3直接用于VP3的原核表達(dá)載體的構(gòu)建，即用HindⅢ和BamHⅠ將VP3基因從pTVP3中酶切，回收的VP3與經(jīng)過同樣酶切回收的原核表達(dá)載體pET-28a進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)菌，重組載體的鑒定通過菌落PCR和雙酶切法進(jìn)行，并命名為pET-VP3。

1.6 JS7-VP3基因的原核表達(dá)及產(chǎn)物的Western-Blot分析

將經(jīng)過鑒定的pET-VP3菌株接種到2×YT培養(yǎng)基中37 ℃ 180 r/min培養(yǎng)過夜，按1 ∶100比例加入過夜培養(yǎng)的上述培養(yǎng)液。于37 ℃搖床，220 r/min，培養(yǎng)4 h左右，使其D600 nm值達(dá)0.6，加入終濃度達(dá)1.0 mmol/L 的IPTG，于37 ℃搖床中，220 rap/min培養(yǎng)4～5 h，收集菌體，PBS洗滌2次后加入100 μL 2×SDS上樣緩沖液，并于100 ℃水浴煮沸 10 min，12 000 r/min離心10 min，上清液通過SDS-PAGE進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳鑒定。確定表達(dá)后，將含有表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE凝膠按常規(guī)方法轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，封閉液作用 1 h。按1 ∶400加入抗IBDV多抗血清，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜5次后加入HRP標(biāo)記兔抗雞IgG二抗 (1 ∶20 000)孵育1 h。TBST洗膜3次，洗去未結(jié)合的二抗。將膜取出放入含DAB顯色液的暗盒里，作用10～30 min，使其顯色，觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 IBDV JS7-VP3基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

用Trizol法提取JS7的dsRNA，以獲得的dsRNA為模板對(duì)VP3片段進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，所得片段與預(yù)期的目的片段大小相符，約為774 bp，結(jié)果見圖1。

2.2 JS7-VP3基因的測(cè)序結(jié)果及分子特征

陽(yáng)性克隆pTVP3經(jīng)過測(cè)序，所獲得的VP3基因大小為774 bp，與預(yù)期目的片段大小相符。同源性分析中JS7-VP3與Gx株等vvIBDV參考株的核苷酸和氨基酸同源性分別為97.8%～99.2%和98.8%～100.0%，與致弱毒株的同源性分別為96.1%～96.5%和98.1%～98.4%，與血清2型參考株的同源性也分別達(dá)到了86.3%和94.2%。將JS7-VP3的氨基酸序列與所用參考株進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)JS7-VP3在關(guān)鍵的氨基酸位點(diǎn)上表現(xiàn)為981P、990A、1005A，而致弱毒株參考株在這些位點(diǎn)上表現(xiàn)為981L、990A、1005T，vvIBDV參考株則表現(xiàn)為981P、990V、1005A。

2.3 JS7-VP3基因的遺傳進(jìn)化分析

JS7-VP3與所有參考株VP3基因在遺傳進(jìn)化樹中被分成3個(gè)大支，JS7與vvIBDV參考株同屬于一個(gè)大分支，并與HK46親緣關(guān)系最近，而致弱毒株參考株同屬于一個(gè)分支，血清2型毒株單獨(dú)屬于一個(gè)分支，結(jié)果見圖2。

2.4 JS7-VP3原核表達(dá)的構(gòu)建及其表達(dá)結(jié)果

將VP3基因從pT-VP3亞克隆入原核表達(dá)載體pET-28a，經(jīng)過菌落PCR鑒定，疑似菌落出現(xiàn)了774 bp目的條帶，將該菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，出現(xiàn)了約5.3 kb的載體片段和774 bp的目的片段，表明pET-VP3構(gòu)建成功(圖3)。重組表達(dá)載體經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE檢測(cè)，pET-VP3菌出現(xiàn)1條32 ku左右的特異性蛋白條帶，經(jīng)Western-Blot鑒定，該蛋白條帶能與IBDV陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)(圖4)，表明克隆的JS7-VP3成功表達(dá)。

3 討論與結(jié)論

在IBDV分子流行病學(xué)研究中，VP2高變區(qū)分子特征分析是主要的研究靶分子[5-6]，然而更多的研究表明，IBDV其他區(qū)域也與IBDV的毒力變化有關(guān)[7-9]，VP3是其中的一個(gè)重要基因。本研究通過對(duì)1株IBDV分離株JS7株的VP3基因分子特征分析發(fā)現(xiàn)，JS7-VP3基因在關(guān)鍵的氨基酸位點(diǎn)上表現(xiàn)為981P、990A、1005A，在981、1005位點(diǎn)上與vvIBDV有關(guān)，而在990位點(diǎn)上則與致弱毒株有關(guān)，但在同源性和遺傳進(jìn)化分析中，JS7-VP3則更接近于vvIBDV，筆者所在課題組前期進(jìn)行的致病性試驗(yàn)[10]也發(fā)現(xiàn)，該毒株在商品雞上的死亡率僅為10%，遠(yuǎn)低于vvIBDV毒株NN1172引起的死亡率。VP3蛋白上的羧基端981、990、1005位點(diǎn)是目前發(fā)現(xiàn)的不同毒株之間有突變的位點(diǎn)，而其羧基端也被認(rèn)為與病毒的致病性相關(guān)。Wang等在分析vvIBDV Gx株和致弱毒株Gt株的基因組時(shí)發(fā)現(xiàn)，這2個(gè)毒株在VP3上的981、990、1005位點(diǎn)有差異，他們的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，將致弱毒株Gt株的990A變成V后，影響了重組病毒在CEF上的復(fù)制能力[3]。在王偉的研究中，vvIBDV毒株GX8/99在SPF雞胚和CEF連續(xù)傳代后，該毒株也在這3個(gè)位點(diǎn)上發(fā)生改變，后與弱毒株完全一致，改變后的毒株再連續(xù)回雞后，990位點(diǎn)仍然保持為A不變，1005位為T不變，與弱毒株一致，981位點(diǎn)則發(fā)生回復(fù)突變[11]。在對(duì)JS7的背景進(jìn)行查詢時(shí)發(fā)現(xiàn)，該毒株分離于免疫雞群，結(jié)合其死亡率低和VP3的分子特征，推測(cè)JS7發(fā)病雞群很可能是由活苗污染、生物安全措施不到位、沒有采取全進(jìn)全出等造成疫苗毒在雞場(chǎng)不斷回雞造成的[10]。在Boot等的研究中，將血清Ⅱ型毒株的VP3基因羧基端取代Ⅰ型的vvIBDV后的重組病毒，其對(duì)SPF雞的毒力大大的減弱[12]。此外，在Jagadish等的研究中，VP3蛋白中與抗原相關(guān)的位點(diǎn)位于860～923位氨基酸之間，而筆者通過分析發(fā)現(xiàn)，不同毒株以及本分離株在VP3的860～923位點(diǎn)之間同源性均較高，僅僅在羧基端的981、990、1005位點(diǎn)上表現(xiàn)出差異[13-14]。因此，本研究結(jié)果也進(jìn)一步提示，在VP3基因分子特征分析中，尤其是羧基端的分析將在IBDV分子流行病學(xué)研究中發(fā)揮越來越重要的作用，值得關(guān)注。

本試驗(yàn)成功構(gòu)建了JS7-VP3的原核表達(dá)載體pET-VP3，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后主要以包涵體形式表達(dá)，重組蛋白能夠和雞IBDV高免血清發(fā)生特異性反應(yīng)，表明利用pET-28a系統(tǒng)表達(dá)的VP3蛋白具有良好的免疫原性。pET系統(tǒng)是常用的一個(gè)高效原核表達(dá)系統(tǒng)，目的基因受噬菌體T7啟動(dòng)子的強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及翻譯信號(hào)控制，在IPTG誘導(dǎo)下，高效表達(dá)其下游的外源基因，表達(dá)量可高達(dá)菌體蛋白的50%[15-17]。張改平等用pET系統(tǒng)對(duì)IBDV-VP3進(jìn)行了表達(dá)，結(jié)果獲得了2種不同分子量且都與IBDV陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物，而本研究結(jié)果利用該系統(tǒng)則獲得了一種表達(dá)產(chǎn)物[17-18]，與Deng等的結(jié)果[19]一致，單一表達(dá)產(chǎn)物更利于對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化及相應(yīng)的特異性抗體研制，為進(jìn)一步研究IBDV特異性的檢測(cè)方法的建立以及VP3在IBDV致病性中的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

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