劉國娟， 劉殿紅， 王 闖， 劉 敏， 徐 寧， 孫曉慧

(聊城職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山東聊城 252000)

蘋果(MluspumilaMill)屬薔薇科、仁果亞科蘋果屬，原產(chǎn)歐洲、亞洲，已成為世界四大水果之一[1]。蘋果的生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)，風(fēng)味獨(dú)特，耐貯藏，且供應(yīng)周期長[2]。我國是世界第一大蘋果生產(chǎn)國，主要集中在渤海灣、西北黃土高原、黃河故道和西南冷涼高地四大產(chǎn)區(qū)。蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展?fàn)顩r對(duì)果區(qū)經(jīng)濟(jì)振興、市場(chǎng)供應(yīng)和出口創(chuàng)匯影響巨大，在我國水果業(yè)中占最重要的地位[3]。柱型蘋果是一種新的蘋果品種類型，這類蘋果因其株形類似直立的支柱，而稱為柱型蘋果(columnar apple)，又稱芭蕾蘋果(ballerina apple)[4-5]，這類蘋果品種在田間表現(xiàn)出樹體極緊湊、萌芽率極高和節(jié)間短而粗的特點(diǎn)，非常適于設(shè)施內(nèi)高密栽培[6]。

GA3作為植物內(nèi)源激素，可促進(jìn)植物細(xì)胞伸長、莖伸長、葉片擴(kuò)大，加速生長和發(fā)育，使作物提早成熟，并增加產(chǎn)量或改進(jìn)品質(zhì)[7]；能打破休眠，促進(jìn)發(fā)芽；減少器官脫落，提高果實(shí)的結(jié)實(shí)率或形成無籽果實(shí)等[8]。GA3最顯著的效應(yīng)是促進(jìn)莖的節(jié)間伸長，而且效果比生長素更為顯著，但節(jié)間數(shù)不改變，節(jié)間長度的增加是由于細(xì)胞伸長和細(xì)胞分裂的結(jié)果。

對(duì)GA3的生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，它主要通過增強(qiáng)淀粉酶mRNA合成、膜透性和膜結(jié)合的多聚核糖體增生，促進(jìn)淀粉酶的合成；以及通過抑制IAA氧化酶或過氧化酶的活性，促進(jìn)生長素的生物合成來調(diào)節(jié)生長素的水平，從而對(duì)植物的生長起促進(jìn)作用[9-10]。細(xì)胞壁的松弛是細(xì)胞伸長所必需的，一般認(rèn)為細(xì)胞壁的松弛是酶促反應(yīng)過程。在植物細(xì)胞壁的松弛及其他一些需要細(xì)胞伸長的發(fā)育過程中，ROS(reactive oxygen species)發(fā)揮著決定性的作用，超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)等是能夠分解ROS的重要抗氧化酶，是植物體內(nèi)氧化還原反應(yīng)動(dòng)態(tài)平衡的指示劑[11]，許多初級(jí)和次級(jí)代謝發(fā)揮著重要的生理作用，例如清除H2O2參與木質(zhì)化發(fā)育過程等[12]。

本試驗(yàn)采用柱型蘋果富士×特拉蒙、普通型蘋果嘎拉施加不同濃度外源GA3處理的組培苗為試材，柱型蘋果富士×特拉蒙、普通型蘋果嘎啦為對(duì)照，研究了柱型蘋果、普通型蘋果組培苗施加外源GA3后，蘋果幼苗中SOD、POD和α-淀粉酶含量的變化，初步探討了柱型蘋果和普通型蘋果葉片中氧化酶與外源GA3的關(guān)系，旨在揭示葉片內(nèi)各種酶與GA3的關(guān)系，以及GA3濃度與蘋果組培苗生長勢(shì)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

特拉蒙×富士柱型蘋果和普通型蘋果嘎拉。

1.2 方法

1.2.1 MS培養(yǎng)基的配制 配制1 L MS培養(yǎng)基：100 mL大量元素(10倍液)+10 mL微量元素(10倍液)+10 mL鐵鹽(100倍液)+10 mL有機(jī)物(100倍液)+10 mL CaCl2(100倍液)+1 mL NAA(1 mg/L)+1 mL 6-BA(0.1 mg/L)置容量瓶中，再加入7 g瓊脂，30 g蔗糖，溶解混勻，先加熱沸騰，再定容至1 L，用0.5 mol/L NaOH調(diào)pH值至5.8～6.2之間，121 ℃下大三角瓶內(nèi)高壓蒸汽滅菌15 min。

1.2.2 培養(yǎng)基分裝 按試驗(yàn)要求每次吸取75、150、300、600、1 200 μL母液于1 L MS液態(tài)固體培養(yǎng)基中，即可配成含0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/L GA3的MS培養(yǎng)基。每1 L MS培養(yǎng)基可分裝20瓶。

1.2.3 培養(yǎng)觀察和取樣 接種完畢后將組培瓶置于26～28 ℃ 的恒溫培養(yǎng)箱中，光照條件下培養(yǎng)，觀察記錄蘋果幼苗發(fā)芽情況、生長狀況。

1.3 測(cè)定方法

SOD測(cè)定采用氮藍(lán)四唑法，依據(jù)SOD抑制NBT(氮藍(lán)四唑)在光下的還原程度來確定SOD活性的大小，活性單位以抑制NBT光化還原的50%為1個(gè)酶活性單位(U)[13]。POD測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[13]；參考李合生的α-淀粉酶活性測(cè)定方法[13]測(cè)定α-淀粉酶的活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源GA3對(duì)柱型蘋果和普通型蘋果表型的影響

2.1.1 外源GA3對(duì)柱型蘋果富士×特拉蒙組培苗表型的影響 柱型蘋果富士×特拉蒙組培苗在不同濃度的GA3上培養(yǎng)16 d后，其組培苗新梢生長狀態(tài)存在差異(圖1)。GA3在一定濃度內(nèi)，均能促進(jìn)蘋果組培苗新梢的生長，當(dāng)GA3的濃度為 0～4 mg/L 時(shí)，均能促進(jìn)富士×特拉蒙新梢的生長。當(dāng)GA3濃度為8 mg/L時(shí)，蘋果組培苗新梢的生長受到明顯的抑制(圖1-F)，植株株高明顯變矮，節(jié)間變短，但分枝數(shù)量明顯增多。

2.1.2 外源GA3對(duì)普通型蘋果嘎啦組培苗表型的影響 普通型蘋果嘎啦組培苗添加不同濃度的GA3培養(yǎng)16 d后，在一定濃度范圍內(nèi)顯著促進(jìn)蘋果組培苗生長，當(dāng)超出一定濃度范圍，則抑制其新梢的生長(圖2)。當(dāng)GA3的濃度為0～2 mg/L 時(shí)，處理均能促進(jìn)普通型蘋果新梢的生長。隨著GA3濃度的增加，促進(jìn)分枝，但抑制節(jié)間伸長(圖2-E)。當(dāng)GA3濃度為8 mg/L時(shí)，蘋果組培苗新梢的生長受到明顯的抑制(圖2-F)。同時(shí)，植株株高明顯變矮，節(jié)間變短，但分枝數(shù)量明顯增多，表現(xiàn)為簇生狀態(tài)。

2.1.3 外源GA3對(duì)柱型和普通型蘋果新梢生長影響的比較 不同濃度的GA3處理能明顯促進(jìn)柱型蘋果富士×特拉蒙和普通型蘋果嘎啦新梢的生長，其新梢增長量均高于對(duì)照(圖3)。但處理16 d后，柱型蘋果對(duì)GA3產(chǎn)生的反應(yīng)較慢，其新梢生長增加量不明顯(圖3-A)；而普通型蘋果對(duì)GA3反應(yīng)非常敏感，產(chǎn)生的反應(yīng)非?？欤律疑L增加量很明顯(圖3-B)。二者不同之處還在于，當(dāng)GA3濃度為4.0 mg/L時(shí)，富士×特拉蒙的新梢增長量最大，說明富士×特拉蒙新梢生長的GA3最敏感濃度為4.0 mg/L；相對(duì)而言，普通型蘋果嘎啦新梢生長的GA3最敏感濃度為2.0 mg/L。

2.2 GA3對(duì)蘋果組培苗SOD和POD酶活性的影響

2.2.1 GA3對(duì)柱型蘋果和普通型蘋果組培苗SOD和POD酶活性的影響 GA3處理16 d后，POD活性的變化比較明顯(圖4)。富士×特拉蒙蘋果組培苗節(jié)間的POD含量明顯提高。在0～2.0 mg/L濃度范圍內(nèi)，隨著GA3濃度的增加，POD活性隨著GA3濃度的提高而增加，當(dāng)GA3濃度為1.0 mg/L時(shí)，POD活性達(dá)到最高，當(dāng)其超過2.0 mg/L時(shí)，POD活性開始下降，但是仍舊高于對(duì)照的POD活性。而普通型蘋果嘎啦的POD活性變化并不明顯，GA3濃度在0～1.0 mg/L濃度范圍內(nèi)，隨濃度的增加而提高，1.0 mg/L濃度時(shí)，POD活性達(dá)到最大值，超過1.0 mg/L逐漸呈下降趨勢(shì)，GA3濃度 8.0 mg/L 時(shí)POD活性降至最低。說明外源GA3可以促進(jìn)普通型蘋果組培苗節(jié)間的POD活性，但富士×特拉蒙的POD活性明顯高于普通型蘋果，說明POD活性與樹體矮化程度呈正相關(guān)。

此外，GA3處理16 d后，隨著GA3濃度的增加，富士×特拉蒙組培苗的SOD活性明顯下降。在0～2.0 mg/L濃度范圍內(nèi)，隨著GA3濃度的增加，SOD活性變化不明顯，當(dāng)濃度為1.0 mg/L時(shí)，SOD活性達(dá)到最大。GA3濃度超過1.0 mg/L時(shí)，其SOD活性明顯下降，在4.0 mg/L時(shí)，SOD活性降至最低，說明外源GA3抑制柱型蘋果組培苗節(jié)間SOD的活性，普通型蘋果與柱型蘋果節(jié)間SOD活性大體一致，都是呈下降趨勢(shì)，但是普通型蘋果的SOD活性略高于柱型蘋果。

2.3 GA3對(duì)柱型蘋果和普通型蘋果組培苗α-淀粉酶活性的影響

試驗(yàn)結(jié)果(圖5)表明，GA3處理16 d后，柱型蘋果和普通型蘋果α-淀粉酶活性有明顯的變化，不管是富士×特拉蒙還是嘎啦蘋果組培苗節(jié)間的α-淀粉酶都受GA3的誘導(dǎo)。在0～2.0 mg/L濃度范圍內(nèi)，隨著GA3濃度的增加，富士×特拉蒙α-淀粉酶活力呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，隨后加強(qiáng)，濃度增至2.0 mg/L時(shí)，α-淀粉酶活性達(dá)到最大，隨著濃度的再次增加，α-淀粉酶活性迅速下降，與普通型蘋果相比，柱型蘋果變化很明顯，說明2.0 mg/L是GA3促進(jìn)柱型蘋果α-淀粉酶活性的最佳反應(yīng)濃度，普通型蘋果的變化則不那么明顯，在0.5 mg/L時(shí)α-淀粉酶活性達(dá)到最大，隨著濃度的不斷增加，α-淀粉酶活性不斷下降。但在0～2.0 mg/L濃度范圍內(nèi)，普通型蘋果的α-淀粉酶活性要大于柱型蘋果，說明普通型蘋果初期受GA3影響較大。

3 討論

3.1 GA3與SOD和POD的關(guān)系

對(duì)柱型蘋果的研究集中在相關(guān)酶活性和內(nèi)源激素水平的測(cè)定上，本研究發(fā)現(xiàn)具有矮化生長特性的柱型蘋果富士×特拉蒙POD、SOD酶活性與生長勢(shì)密切相關(guān)，柱型蘋果葉片內(nèi)的POD、SOD酶活性顯著高于普通型蘋果。外源GA3處理后，不管是柱型蘋果富士×特拉蒙還是普通型蘋果嘎啦，其SOD活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而POD活性則呈上升趨勢(shì)， 這也證明了，POD活性與樹體矮化程度呈顯著正相關(guān)， 酶活性越高，矮化程度越大[14]。

3.2 GA3與α-淀粉酶的關(guān)系

GA3是誘導(dǎo)多種植物一些組織中α-淀粉酶的必要條件，α-淀粉酶為淀粉水解過程重要的水解酶，現(xiàn)已用α-淀粉酶來檢測(cè)植物組織中GA的響應(yīng)狀態(tài)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)外源GA3能促進(jìn)柱型蘋果富士×特拉蒙和普通型蘋果嘎啦α-淀粉酶的活性，但在測(cè)定過程中，柱型蘋果和普通型蘋果組培苗內(nèi)α-淀粉酶不太穩(wěn)定，很可能因?yàn)槊傅男再|(zhì)不穩(wěn)定導(dǎo)致的。

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