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高羊茅FaHsfC1b啟動(dòng)子克隆及外源激素處理下FaHsfC1b的表達(dá)分析

2018-03-14 06:20楊志民莊黎麗
江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年3期
關(guān)鍵詞:高羊茅根部元件

曹 薇, 楊志民, 莊黎麗, 王 劍, 孫 巖

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,江蘇南京 210095)

作為一種多年生冷季型草坪草,高羊茅(Festucaarundinacea)具有抗病蟲(chóng)害、成坪快、耐修剪等多種優(yōu)點(diǎn),因此在我國(guó)溫帶南部和亞熱帶地區(qū)得到了廣泛的種植。在溫帶以北,如北京地區(qū),高羊茅在越冬時(shí)遭受冷脅迫,導(dǎo)致其通?;畈贿^(guò)2年,被稱為“短命草”,而在亞熱帶地區(qū),夏季高溫以及高溫帶來(lái)的缺水也嚴(yán)重影響著高羊茅的生長(zhǎng),提高高羊茅對(duì)非生物脅迫的抵抗能力有益于節(jié)約草坪管理成本,進(jìn)一步擴(kuò)大高羊茅草坪草在我國(guó)的使用范圍。

植物熱激轉(zhuǎn)錄因子(heat stress transcription factors,Hsfs)是存在于植物細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)熱激蛋白表達(dá)的一類轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因,在植物熱脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和耐熱性的產(chǎn)生過(guò)程中具有重要作用[1]。熱激轉(zhuǎn)錄因子在結(jié)構(gòu)上可以分為3類:A類、B類、C類。A類熱激轉(zhuǎn)錄因子是熱激基因表達(dá)的激活劑,在不同的植物中具有不同的應(yīng)激反應(yīng)[1],多項(xiàng)研究表明,此類熱激轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆境尤其是抗熱方面起到重要作用[2-4]。B類熱激轉(zhuǎn)錄因子本身沒(méi)有轉(zhuǎn)錄激活功能,在番茄抗熱性形成的不同階段中,HsfB1和HsfA1a可以形成一個(gè)增效的共激活子[5]。另外,在熱脅迫下HsfB1可以跟其他熱激轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合控制或抑制看家基因的表達(dá)[6]。與A類Hsfs相類似,熱脅迫下的轉(zhuǎn)錄組分析顯示,C類熱激轉(zhuǎn)錄因子HsfCs在水稻(Oryzasativa)、小麥(Triticumaestivum)、白菜(Brassicapekinensis)、椪柑(CitrusreticulataBlanco)、胡蘿卜(Daucuscarota)、豌豆(Pisumsativum)、簸箕柳(Salixsuchowensis)中普遍上調(diào)表達(dá),在其中某些物種中,HsfCs也響應(yīng)滲透脅迫、冷脅迫、ABA[7-13]。到現(xiàn)在為止,對(duì)于C類熱激轉(zhuǎn)錄因子的研究較少,僅發(fā)現(xiàn)水稻缺失OsHsfC1b后,對(duì)鹽脅迫、干旱脅迫及ABA敏感,在非脅迫條件下,OsHsfC1b對(duì)水稻的生長(zhǎng)是不可缺少的[14]。目前對(duì)多年生草坪草尤其是高羊茅中C類熱激轉(zhuǎn)錄因子的功能及其上游調(diào)控因子缺乏研究。

啟動(dòng)子是DNA分子與RNA聚合酶特異結(jié)合的部位,負(fù)責(zé)下游基因的轉(zhuǎn)錄激活,對(duì)于基因的表達(dá)非常重要。伊淑瑩[15]等研究獲得了番茄線粒體小分子熱激蛋白基因LeMTsHSP起始密碼子上1 915 bp的調(diào)控序列,可能對(duì)該基因的表達(dá)具有增強(qiáng)作用。高溫下小麥(Triticumaestivum)Hvhsp17啟動(dòng)子能驅(qū)動(dòng)Hvhsp17在小麥中表達(dá)[16]。在不同類型的啟動(dòng)子中,有一類被稱為激素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,激素首先與植物體內(nèi)的特定受體相結(jié)合,受體蛋白被激活后與啟動(dòng)子結(jié)合,從而激活下游基因的表達(dá),使植物發(fā)生一系列生理反應(yīng)。如果植物缺少相應(yīng)的受體基因或啟動(dòng)子,就不會(huì)對(duì)激素起反應(yīng)[17]。目前研究較多的有水楊酸(SA)、脫落酸(ABA)、赤霉素(GA)、生長(zhǎng)素(IAA、NAA等)等激素響應(yīng)啟動(dòng)子。不同激素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子需要具有相應(yīng)的激素響應(yīng)元件,比如在擬南芥RD29B啟動(dòng)子中存在2個(gè)ABA響應(yīng)元件ABRE,只有這2個(gè)元件相互作用形成ABA應(yīng)答復(fù)合體,才能使其所在的啟動(dòng)子表現(xiàn)出ABA誘導(dǎo)活性[18]。

植物激素在植物抗逆性中發(fā)揮著重要的作用,ABA含量在大豆熱激恢復(fù)階段會(huì)明顯快速升高[19-20],而ABA不敏感型突變體abi1和abi2則表現(xiàn)為耐熱性變差[21]。水稻中的OsHsfC1b被證實(shí)依賴ABA提高水稻對(duì)鹽脅迫的抗性[14],并且已經(jīng)在A類的熱激轉(zhuǎn)錄因子中發(fā)現(xiàn)了富集ABA應(yīng)答原件(ABRE)的順式調(diào)控模塊,這表明了ABA在一些熱激轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的介導(dǎo)作用[22]。SA能夠在植物遭受逆境時(shí)及時(shí)清除ROS,維持抗氧化酶的活性,從而保護(hù)脅迫下細(xì)胞膜的穩(wěn)定性[23]。生長(zhǎng)素和赤霉素作為植物激素普遍參與了植物在正常條件和脅迫條件下的各種生理機(jī)制[24-27]。研究發(fā)現(xiàn),大麥和擬南芥在熱脅迫下,伴隨著內(nèi)源生長(zhǎng)素含量的降低,編碼生長(zhǎng)素合成的關(guān)鍵基因表達(dá)量也出現(xiàn)下調(diào),并導(dǎo)致雄性不育,這些性狀可以通過(guò)外施生長(zhǎng)素得到恢復(fù)[28]。赤霉素還參與調(diào)解生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素的拮抗作用[29]。

基于已有高羊茅品種凌志的全長(zhǎng)序列,我們?cè)O(shè)計(jì) 5′RACE 引物,通過(guò)染色體步移法分離FaHsfC1b上游啟動(dòng)子并克隆,隨后利用啟動(dòng)子分析網(wǎng)站對(duì)該基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用調(diào)控元件及其功能進(jìn)行分析,并根據(jù)啟動(dòng)子中出現(xiàn)的激素響應(yīng)元件,對(duì)激素處理下FaHsfC1b的表達(dá)量進(jìn)行了測(cè)定,從而為高羊茅C類熱激轉(zhuǎn)錄因子的分子調(diào)控機(jī)制研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與菌株

試驗(yàn)于2015年9—12月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)學(xué)院草坪分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。高羊茅(Festucaarundinacea)品種凌志材料為筆者所在實(shí)驗(yàn)室草坪種質(zhì)資源圃自有品種。選取實(shí)驗(yàn)室資源圃高羊茅植株,洗去根部泥土并去掉枯葉后將植株分蘗從整株上分離下來(lái),剪去根部,將分蘗種植于霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液[30]中,營(yíng)養(yǎng)液上置泡沫板以海綿包裹分蘗節(jié)支撐植株,按照1/3原則修剪葉片,培養(yǎng)條件為白天、夜晚各12 h,白天溫度25 ℃,夜晚溫度20 ℃。其后每周換1次營(yíng)養(yǎng)液,待 2~3周后,分蘗節(jié)發(fā)育成較大植株,側(cè)根也長(zhǎng)出10~15 cm,即可更換營(yíng)養(yǎng)液并對(duì)高羊茅進(jìn)行處理。

pMD19SimpleT載體購(gòu)自TaKaRa公司,大腸桿菌菌株DH5α為筆者所在實(shí)驗(yàn)室凍存。引物合成及DNA測(cè)序均在南京思普金生物公司完成。

1.2 方法

1.2.1 高羊茅FaHsfC1b啟動(dòng)子的克隆 高羊茅FaHSFC1b啟動(dòng)子的克隆采用染色體步行法,具體步驟參考李廣平等的方法[31]和BD Genome WalkerTMUniversal Kit User Manual說(shuō)明書(shū)。2條基因特異反向引物分別為:NGSP1:5′-TCGT-GCTCTGCTCGGCGTGGT-3′;NGSP2:5′-TACCTCGCTCTGT-GCGTGCCG-3′。重新驗(yàn)證啟動(dòng)子所設(shè)計(jì)的引物序列為:F:5′-CAGAGCAGAAGTGGTGATGGT-3′;R:5′-GAGGAG-GAAGTCGGAGAAGGC-3′。

1.2.2FaHsfC1b啟動(dòng)子序列分析 采用GenBank在線比對(duì)工具BLASTn(http://blast. ncbi. nlm.nih. gov/)[32]進(jìn)行了序列同源性分析,啟動(dòng)子序列調(diào)控元件分析利用植物順勢(shì)調(diào)控元件數(shù)據(jù)庫(kù)PlANTCARE(http://bio informatics. psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/)[33]和PLACE(http://www. dna. affrc. go. jp/PLACE/signalscan.html)[34]完成。

1.2.3 外源激素處理 將水培2周左右的高羊茅植株轉(zhuǎn)移到分別含有ABA(100 μmol/L)、GA(90 mg/L)、IAA(60 mg/L)、SA(0.5 mmol/L)、ZT(0.5 mg/L)的營(yíng)養(yǎng)液中處理24 h,在0、4、12、24 h取根部和葉片,每個(gè)處理取3個(gè)重復(fù),培養(yǎng)條件與處理前相同。

1.2.4 高羊茅總RNA的提取與基因表達(dá)分析 總RNA提取采用試劑盒Plant RNA Kit(50)(Omega Bio-Tec,American),用于熒光定量PCR的cDNA采用試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)(TaKaRa,Otsu,Japan)合成,通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)FaHsfC1b在不同激素處理下的表達(dá)情況。采用SYBR Green Ⅰ Master反應(yīng)體系(Roche Diagnostic,Rotkreuz,Switzerland),在LightCycler 480 Ⅱ(Roche,Rotkreuz,Switzerland)儀器中進(jìn)行。以FaTublin作為內(nèi)參基因,使用如下引物:RT-FaHsfC1b-F:ACTTCAAGCACCGCAACTTT;RT-FaHsfC1b-R:TGAACCGGCCTTCTTCTTCT;RT-FaTublin-F:ATGCTTT-CGTCTTATGCCC;RT-FaTublin-R:CTCTTGGTTTTGATGG-TTGC。

2 結(jié)果與分析

2.1 FaHsfC1b啟動(dòng)子克隆

構(gòu)建的獲得克隆經(jīng)測(cè)序后與已有序列進(jìn)行拼接和比對(duì),以構(gòu)建的高羊茅葉片基因組酶解DNA片段文庫(kù)為模板,經(jīng)過(guò)2輪PCR后,從高羊茅的EcoRⅠ酶切體系中擴(kuò)增到1條 1 562 bp 左右的片段(圖1)。將該片段進(jìn)行克隆,連接到pMD19SimpleT并測(cè)序,結(jié)果顯示,獲得的片段實(shí)際長(zhǎng)度為 1 514 bp。與已有的高羊茅FaHSFC1b基因(登錄號(hào):KY475613)序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)所得到的序列與高羊茅FaHSFC1b序列有95 bp的重疊區(qū),表明所得到的序列是其上游的DNA序列。進(jìn)一步設(shè)計(jì)1對(duì)驗(yàn)證引物,克隆分析整理后,共得到高羊茅FaHSFC1b基因上游長(zhǎng)度為1 657 bp的DNA序列。

2.2 FaHsfC1b啟動(dòng)子序列生物信息學(xué)分析

通過(guò)順式作用元件數(shù)據(jù)庫(kù)PLACE和PlANTCARE對(duì)FaHsfC1b啟動(dòng)子的分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)FaHsfC1b啟動(dòng)子很多個(gè)位點(diǎn)上都有啟動(dòng)子核心元件TATA-box,即RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn),確保了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的高度靈活性,多個(gè)CAAT-box則控制著轉(zhuǎn)錄起始的頻率(表1)。

除了核心元件,F(xiàn)aHsfC1b啟動(dòng)子中包含的元件按照功能大致可以分為6類(表1)。第一類為光信號(hào)相關(guān)元件,在啟動(dòng)子中數(shù)量最多、范圍最廣,多達(dá)16種,有-10PEHVPSBD、box Ⅱ、chs-Unit 1 m1、G-box、GAG-motif、GBOXLERBCS、I-box、INRNTPSADB、MNF1、MRE、PRECONSCRHSP70A、REBETALGLHCB21、SORLIP2AT、SORLIP1AT、Sp1、TBOXATGAPB。第二類是與抵抗逆境相關(guān)的元件,集中在干旱、冷/寒、鹽及病害方面,包括綜合性防御元件(同時(shí)具備抵抗2種或2種以上逆境相關(guān)元件):DOFCOREZM(多種脅迫防御)、DPBFCOREDCDC3(病原與高鹽脅迫)、GT1GMSCAM4(病害與鹽脅迫)包括脫水響應(yīng)元件:DRECRTCOREAT、MYCATRD22;低溫響應(yīng)元件:LTRECOREATCOR15、LTRE1HVBLT49;抗病相關(guān)元件:GT1CONSENSUS、SEBFCONSSTPR10A、WBOXATNPR1。還有一種缺氧相關(guān)的缺氧特異性誘導(dǎo)增強(qiáng)元件:GC-motif,猜測(cè)可能與澇害相關(guān)。第三類是組織特異性元件,它們參與調(diào)控基因在不同植物組織中的表達(dá),包括分生組織:CAT-box;葉肉細(xì)胞:CACTFTPPCA1;花粉:GTGANTG10、POLLEN1LELAT52;根瘤組織:OSE1ROOTNODULE、OSE2ROOTNODULE;根毛:RHERPATEXPA7;種子:RYREPEATBNNAPA;胚乳:Skn-1_motif。第四類為特殊物質(zhì)響應(yīng)元件,有蔗糖應(yīng)答元件:RAV1AAT、SREATMSD;銅應(yīng)答元件:CURECORECR;硫應(yīng)答元件:SURECOREATSULTR11。第五類是一些與基因、酶及蛋白結(jié)合的位點(diǎn)。

此次研究重點(diǎn)觀察到的第六類是激素響應(yīng)元件,包括細(xì)胞分裂素調(diào)節(jié)基因ARR1結(jié)合位點(diǎn):ARR1AT;脫落酸響應(yīng)元件:ABRE、MYB2CONSENSUSAT;生長(zhǎng)素響應(yīng)元件:CATATGGMSAUR;乙烯響應(yīng)元件:GCCCORE、WBOXNTERF3;水楊酸響應(yīng)元件:TCA-element;赤霉素響應(yīng)元件:PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A、WRKY710S,另外WRKY710S元件也與創(chuàng)傷有關(guān);調(diào)節(jié)類黃酮生物合成元件:MYBCORE。

綜合上述分析,可知克隆到的啟動(dòng)子序列可能與光照周期、光照度有關(guān),并且可能通過(guò)響應(yīng)激素誘導(dǎo),調(diào)控下游基因表達(dá),在植物生長(zhǎng)、抗病、抗逆方面發(fā)揮作用。

表1 應(yīng)用PLANTCARE預(yù)測(cè)FaHsfC1b啟動(dòng)子順式作用元件

位點(diǎn)名稱位置信號(hào)序列位點(diǎn)功能DOFCOREZM+22、+238、-407、+857、-1078、+1101、-1134、-1144、+1285、-1296、+1460、-1623、AAAG防御與脅迫響應(yīng)元件DPBFCOREDCDC3+147、-875、-1250、+1343、+1357、+1574ACACNNG病原和高鹽脅迫響應(yīng)元件DRECRTCOREAT-801、-1481RCCGAC脫水響應(yīng)元件EBOXBNNAPA-96、-104、-989、-1242、-1344、1346、-1358、-1432、-1486、CANNTG儲(chǔ)藏蛋白napA的E-boxEECCRCAH1+128、+340、+748、-1120、-1521GANTTNCMyb轉(zhuǎn)錄因子LCR1結(jié)合位點(diǎn)ELRECOREPCRP1-320TTGACC激發(fā)響應(yīng)元件EMBP1TAEM+1358CACGTGGC抗旱、耐寒相關(guān)的反式作用因子GCCCORE-860、-882、+899GCCGCC乙烯響應(yīng)元件G-Box-1202、+1421CACGTG光順式作用調(diào)控元件GATABOX-47、-844、-1158、+1514、-1563、-1629GATAASF-2結(jié)合位點(diǎn)GAG-motif+310、+1149、471GGAGATG光響應(yīng)元件GBOXLERBCS+1357MCACGTGGC光響應(yīng)基因的上游保守序列GT1CONSENSUS-45、+1150、+1276、+1282、+1558GRWAAW調(diào)控抗病基因PR-1a表達(dá),影響水楊酸誘導(dǎo)的基因表達(dá)GT1GMSCAM4+17、+1282GAAAAA在病原或鹽誘導(dǎo)的SCaM-4基因表達(dá)中發(fā)揮作用GTGANTG10+30、+68、-87、+99、+315、-328、+338、-412、-821、-959、+1227、-1409GTGA花粉晚期基因啟動(dòng)子的元件GC-motif+1394CCCCCG缺氧特異性誘導(dǎo)增強(qiáng)元件Ⅰ-box-1626、-46GATAA部分光響應(yīng)元件INRNTPSADB+355、-1220、-1277YTCANTYY光響應(yīng)元件LECPLEACS2-191TAAAATATLeCp結(jié)合的順式元件LTRE1HVBLT49+854CCGAAA低溫響應(yīng)元件LTRECOREATCOR15-810、-812、+1482、-1491、+1553CCGAC低溫響應(yīng)元件MNF1+56GTGCCC(A/T)(A/T)光響應(yīng)元件MRE-341AACCTAA光響應(yīng)MYB結(jié)合元件MYBCORE-561、-1464CNGTTR調(diào)節(jié)類黃酮(一類植保素)生物合成MYB2CONSENSUSAT+561YAACKG脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)錄激活因子MYCATRD22-96、+1344CACATG脫水響應(yīng)元件OSE1ROOTNODULE+238AAAGAT根瘤組織特異性表達(dá)元件OSE2ROOTNODULE+427、+1076CTCTT根瘤組織特異性表達(dá)元件RAV1AAT+915、-1116、-1436CAACA蔗糖應(yīng)答元件REBETALGLHCB21-1629CGGATA光敏色素調(diào)控元件RHERPATEXPA7-210、-605、+1606KCACGW根毛特異元件POLLEN1LELAT52+16、-408、-507、-674、-712、-1071、-1131、-1145、-1642AGAAA花粉特異表達(dá)的順式作用元件ROOTMOTIFTAPOX1+191、-1561ATATTrolD的啟動(dòng)子元件PRECONSCRHSP70A-758、+886、+1372、+1553SCGAYNRNNNNNNNNNNNNNNNHD光響應(yīng)元件PROLAMINBOXOSGLUB1+1098TGCAAAG葡聚糖酶1醇溶谷蛋白元件PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A-1284CCTTTT赤霉素響應(yīng)元件RYREPEATBNNAPA+1034CATGCA在種子特異性表達(dá)中發(fā)揮作用SEBFCONSSTPR10A+761、-1324YTGTCWC抗病相關(guān)元件SEF4MOTIFGM7S+263、-1402RTTTTTRSEF4結(jié)合位點(diǎn)Skn-1_motif+956GTCAT胚乳高水平表達(dá)順式作用調(diào)控元件SORLIP2AT+160、-863、-947、+1030、+1139、-1363GGGCC光響應(yīng)元件SORLIP1AT+162、-272、-550、-633、-689、-734、-880、+1311、-1349、-1361、+1538GCCAC光響應(yīng)元件

位點(diǎn)名稱位置信號(hào)序列位點(diǎn)功能Sp1-385、+1285、-587、-1391、-389、-1386、-744CC(G/A)CCC光響應(yīng)元件SREATMSD+1628TTATCC蔗糖應(yīng)答元件SURECOREATSULTR11-8、+646、-763、-956、+1324GAGAC硫應(yīng)答元件TAAAGSTKST1-1078、-1134TAAAGstdof1蛋白反式作用控制保衛(wèi)細(xì)胞特異基因表達(dá)的靶位點(diǎn)TATA-box-663、+33、+102、-39、-1014、-37、+339、+41、-1375、+34、+109、-40、-1015、-38、+361、+46ATATAT轉(zhuǎn)錄起始-30核心啟動(dòng)子元件TBOXATGAPB-1100ACTTTG涉及基因轉(zhuǎn)錄的光誘導(dǎo)激活TCA-element-434CAGAAAAGGA水楊酸響應(yīng)順式作用元件WBOXATNPR1-321TTGAC調(diào)控抗病基因NPR1表達(dá),影響水楊酸誘導(dǎo)的基因表達(dá)WBOXNTERF3+31、+100、-152、-617、-1111TGACY參與乙烯誘導(dǎo)的ERF3基因的激活WRKY710S+75、-321TGACW-box核心區(qū),赤霉素信號(hào)抑制因子

2.3 不同激素處理下FaHsfC1b的表達(dá)水平分析

為了驗(yàn)證FaHsfC1b啟動(dòng)子序列上存在的激素響應(yīng)元件是否與FaHsfC1b在激素下的表達(dá)調(diào)控有關(guān),我們對(duì)高羊茅進(jìn)行了激素處理試驗(yàn)(圖2),發(fā)現(xiàn)在ABA、GA、IAA、SA、ZT處理下,24 h內(nèi)FaHsfC1b表達(dá)量均呈現(xiàn)上升再下降的趨勢(shì)。ABA處理下,高羊茅根部FaHsfC1b表達(dá)量在4 h開(kāi)始上升并在 12 h 達(dá)到峰值,為對(duì)照的49倍,葉片表達(dá)水平比根部低,同樣在4 h開(kāi)始上升并在12 h達(dá)到峰值,為對(duì)照的19倍。GA處理下根部和葉片中FaHsfC1b表達(dá)量都在4 h達(dá)到峰值,為對(duì)照的7~8倍,隨后葉片中基因表達(dá)量雖有下降但依舊顯著高于對(duì)照,而根部表達(dá)量則下降到處理前水平。IAA處理下高羊茅根部FaHsfC1b表達(dá)量明顯快于也高于葉片中基因表達(dá)量,根部基因表達(dá)量在4 h達(dá)到峰值,并且是對(duì)照的42倍,而葉片則在12 h開(kāi)始出現(xiàn)基因表達(dá)量的上升,與根部相比上升幅度較小,峰值為對(duì)照的11倍。SA和ZT處理下FaHsfC1b表達(dá)量在根部和葉片中的上升/下降趨勢(shì)很相似,但SA處理下高羊茅根部基因表達(dá)量為所有處理中最高水平,在4 h達(dá)到峰值,為對(duì)照的65倍,葉片中FaHsfC1b表達(dá)量則在12 h開(kāi)始上升并在24 h達(dá)到峰值,為對(duì)照的11倍;在ZT處理下,高羊茅根部FaHsfC1b表達(dá)量同樣在4 h達(dá)到峰值,為對(duì)照的15倍,葉片在24 h達(dá)到峰值,是對(duì)照基因表達(dá)量的24倍。

FaHsfC1b對(duì)以上5種激素的響應(yīng)與啟動(dòng)子元件中5種激素響應(yīng)元件相吻合,證明啟動(dòng)子所包含的響應(yīng)元件與下游基因的調(diào)控表達(dá)有一定聯(lián)系。

3 討論與結(jié)論

FaHsfC1b啟動(dòng)子分析表明,該啟動(dòng)子序列中含有豐富的順勢(shì)作用元件和其他應(yīng)答元件。參與低溫響應(yīng)的元件有6個(gè),抗旱相關(guān)元件有4個(gè),鹽脅迫相關(guān)元件有8個(gè),抗病相關(guān)元件有3個(gè),推測(cè)FaHsfC1b可能與高羊茅抗寒、抗旱及抗鹽相關(guān),而已有的研究結(jié)果表明,HsfC1在滲透脅迫、鹽脅迫和冷脅迫中的表達(dá)都很突出[35,37],將水稻中的OsHsfC1b敲除后,轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)滲透脅迫的抗性明顯弱于野生型[14]。

在所有順式作用元件中,數(shù)量最多的是涉及C4植物葉肉特異表達(dá)的順式元件CACTFTPPCA1,此元件是維持C4植物葉肉特異性,因而得以更高效率地利用光照和氮資源的關(guān)鍵元件[38],另一個(gè)發(fā)現(xiàn)是關(guān)于光照的元件,在所有元件中光響應(yīng)元件無(wú)論在種類還是數(shù)量上都是最多的,比較前人對(duì)其他基因啟動(dòng)子的分析,我們可以推測(cè)FaHsfC1b可能存在復(fù)雜的光應(yīng)激反應(yīng)表達(dá)模式,在植物正常的光合作用中起到重要作用。此外,F(xiàn)aHsfC1b啟動(dòng)子中還包含有多個(gè)蔗糖應(yīng)答元件、銅應(yīng)答元件、硫應(yīng)答元件、真菌誘導(dǎo)子元件,猜測(cè)外源施加營(yíng)養(yǎng)、金屬元素或真菌感染可能會(huì)對(duì)FaHsfC1b的轉(zhuǎn)錄發(fā)生影響。啟動(dòng)子中含有的其他基因、酶及蛋白結(jié)合的位點(diǎn)說(shuō)明植物對(duì)外界的應(yīng)激反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的機(jī)制,需要多種物質(zhì)共同協(xié)同作用。

對(duì)FaHsfC1b啟動(dòng)子序列分析的另一結(jié)果顯示,激素響應(yīng)元件所響應(yīng)的激素不僅涵蓋了五大類激素:生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、脫落酸、乙烯,還包括水楊酸、類黃酮,其中細(xì)胞分裂素調(diào)節(jié)基因ARR1結(jié)合位點(diǎn)多達(dá)8個(gè),在啟動(dòng)子的末梢還有個(gè)分生組織表達(dá)順式作用調(diào)控元件CAT-box,猜測(cè)FaHsfC1b的轉(zhuǎn)錄表達(dá)可能對(duì)植物的生長(zhǎng)有影響。大多數(shù)干旱應(yīng)答基因都受脫落酸的誘導(dǎo),已經(jīng)在A類熱激轉(zhuǎn)錄因子中發(fā)現(xiàn)了富集脫落酸應(yīng)答元件的啟動(dòng)子序列[39],這表明脫落酸在C類熱激轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄調(diào)控中可能也有一定的介導(dǎo)作用。組織特異性元件的富集可推測(cè)FaHsfC1b的轉(zhuǎn)錄調(diào)控遍布高羊茅植株的各個(gè)部位。

在本試驗(yàn)中,F(xiàn)aHsfC1b響應(yīng)IAA、ZT、GA、ABA和SA,在FaHsfC1b啟動(dòng)子中,生長(zhǎng)素、赤霉素、脫落酸響應(yīng)元件都有不止1個(gè),而研究表明,啟動(dòng)子中多拷貝應(yīng)答元件可能參與下游基因的增強(qiáng)表達(dá)[40]。當(dāng)干旱脅迫應(yīng)答基因上游啟動(dòng)子序列中含有ABRE元件時(shí),該基因的表達(dá)調(diào)節(jié)依賴ABA調(diào)控途徑,本課題組前期對(duì)FaHsfC1b的研究表明FaHsfC1b響應(yīng)干旱脅迫、冷脅迫和鹽脅迫,而對(duì)OsHsfC1b的研究表明其維持水稻耐旱性依賴于ABA調(diào)控途徑,因此進(jìn)一步猜測(cè)FaHsfC1b可能也具有相同功能[14]。另外研究指出生長(zhǎng)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子往往同時(shí)含有干旱脅迫或其他脅迫相關(guān)的作用元件,表明啟動(dòng)子下游基因的調(diào)控依賴于激素和逆境脅迫的共同作用[41]。

目前除ABA以外,C類熱激轉(zhuǎn)錄因子在其他植物外源激素處理下的表達(dá)分析尚無(wú)報(bào)道,因此猜測(cè)植物激素可能通過(guò)啟動(dòng)子來(lái)調(diào)控FaHsfC1b的表達(dá),進(jìn)而在植物抗逆性中發(fā)揮作用。由于此類激素尤其是生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素和赤霉素和植物生長(zhǎng)密切相關(guān),結(jié)合水稻中的OsHsfC1b在水稻生長(zhǎng)中所扮演的不可缺少的角色[14],進(jìn)一步猜測(cè)FaHsfC1b可能也在高羊茅的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

本研究通過(guò)對(duì)高羊茅FaHsfC1b啟動(dòng)子序列的分析,推測(cè)FaHsfC1b可能在植物激素介導(dǎo)的抗逆性中發(fā)揮重要作用,對(duì)于植物生長(zhǎng)發(fā)育及正常的光合作用可能也是必不可少的。

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