汪新建，樊爽爽，翁少亭，楊國宇，褚貝貝，王 江

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)/農(nóng)業(yè)部動物生化與營養(yǎng)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州450002)

肌肉生長抑制素(MSTN)是肌肉生長的負(fù)調(diào)控因子，其主要功能是抑制肌肉細(xì)胞的增殖和分化［1］。鑒于MSTN對骨骼肌發(fā)育的負(fù)調(diào)控作用，敲除MSTN基因的研究成為熱點(diǎn)。通過構(gòu)建小鼠模型，采用基因敲除技術(shù)對MSTN基因功能研究發(fā)現(xiàn)，敲除掉MSTN基因的小鼠肌肉細(xì)胞明顯增生，整個身體骨骼肌質(zhì)量達(dá)到正常野生型小鼠的2～3倍［2］。

呈簇規(guī)律間斷的短回文重復(fù)序列(Clustered，regularly interspaced， short palindromic repeats，CRISPR)及其相關(guān)蛋白9(Associate protein 9，Cas9)是近些年比較流行的基因組編輯技術(shù)［3］。通過單鏈向?qū)?RNA(Single guide RNA，sgRNA)引導(dǎo) Cas9蛋白在基因組中相應(yīng)的含有基序(Protospaceradjacent motif，PAM)的靶點(diǎn)進(jìn)行切割，斷裂的基因組DNA至少可采用2種修復(fù)機(jī)制進(jìn)行修復(fù)［4］。目前，多種Cas9同系物已經(jīng)被證實(shí)可以用于動物、植物、微生物等體內(nèi)或體外研究［5-10］。金黃色葡萄球菌 Cas9(Staphylococcus aureus Cas9，SaCas9)是其中最小的同系物之一(約3.2 kb)，適合用于病毒介導(dǎo)的基因組編輯［11］。

腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus，AAV)在人或動物中是非致病性的，與其他病毒相比具有更低的免疫原性［12］。AAV載體能夠高效地把外源DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)［13］，已經(jīng)被證實(shí)可以用于人類基因組編輯［14-16］。目前，Cas9和AAV技術(shù)的研究雖然都比較深入，但AAV技術(shù)研究偏向于腫瘤治療，且將二者相融合在一起的研究極少。為此，將Cas9技術(shù)與AAV技術(shù)相融合，以GV487質(zhì)粒作為載體骨架，成功構(gòu)建了敲除MSTN基因的重組載體，鑒定出可作為基因編輯的sgRNA位點(diǎn)，并將含有此位點(diǎn)的重組載體包裝成病毒，為后續(xù)進(jìn)行動物試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。通過改造優(yōu)化的AAV載體，增加其靶向性，減少其免疫原性，有望為相關(guān)疾病的基因治療和轉(zhuǎn)基因新品種的研發(fā)提供新的手段和方法。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

Q5高保真 DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、T7核酸內(nèi)切酶購自NEB公司;DNA切膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司;質(zhì)粒中提試劑盒購自QIAGEN公司;轉(zhuǎn)染試劑FuGENE HD購自Promega公司;高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco公司;PBS購自CORNING公司;pMD19－T載體、DL2000 Marker、50 bp DNA Ladder、SYBR Green試劑盒購自Takara公司;細(xì)胞基因組提取試劑盒購自上海萊楓生物科技有限公司;GV487、pAAV－RC、pHelper質(zhì)粒購自上海吉凱公司;AAV proPurification(All serotypes)試劑盒購自 Clontech公司;293T細(xì)胞、AAV－293細(xì)胞、XL－10 gold感受態(tài)細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI所公布人、豬、鼠MSTN基因序列，在同源序列區(qū)域找到2個合適的(符合SaCas9的PAM序列要求:NNGRRT)靶位點(diǎn)，分別位于MSTN的第一和第二外顯子上(圖1)，同時設(shè)計(jì)T7酶切相應(yīng)位點(diǎn)的檢測引物(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

為進(jìn)一步驗(yàn)證突變情況，通過TA克隆、測序進(jìn)一步確定基因編輯效果。如圖4所示，在送檢的47個有效樣品中，有3個樣品所測序列存在堿基缺失，突變效率為6.4%。

圖1 sgRNA設(shè)計(jì)示意圖

表1 T7酶切位點(diǎn)檢測所用引物

1.2.7 病毒滴度測定 用絕對定量PCR法測定病毒滴度，PCR反應(yīng)按照SYBR Green試劑盒說明進(jìn)行。用質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)曲線，待測樣品與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較后，得到待測樣品的滴度。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 設(shè)置空白對照組(GV487載體轉(zhuǎn)染組)、MSTN－sgRNA1組和 MSTN－sgRNA2組，轉(zhuǎn)染前12 h將處于對數(shù)生長期的293T細(xì)胞以2.0×105個/孔的密度接種24孔板，待細(xì)胞生長達(dá)80%～90%融合度時，取質(zhì)粒 1 μg、DMEM 50 μL、FuGENE 3 μL，混合均勻并室溫靜置5～15 min后，加入各孔。

1.2.6 病毒包裝及純化 轉(zhuǎn)染前將AAV－293細(xì)胞以3×106個/皿的密度接種100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿。取經(jīng)T7核酸內(nèi)切酶鑒定及測序結(jié)果正確的MSTN－sgRNA2 質(zhì)粒與 pAAV－RC、pHelper質(zhì)粒各 10 μg，用FuGENE轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染AAV－293細(xì)胞，2～3 d后重組AAV即在細(xì)胞中包裝完成。

將細(xì)胞及上清收集到15 mL離心管中，200×g離心3 min，將上清另外存放，細(xì)胞沉淀用1 mL PBS重懸。用37℃水浴鍋和－80℃冰箱反復(fù)凍融細(xì)胞沉淀4次，10 000×g離心去除細(xì)胞碎片，將離心上清轉(zhuǎn)移到新離心管中。按照Clontech公司AAV proPurification(All serotypes)試劑盒說明書進(jìn)行操作，對收集的病毒進(jìn)行濃縮提純。

將質(zhì)粒MSTN－sgRNA2與pHelper助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染AAV－293細(xì)胞3 d后，分離純化病毒并進(jìn)行滴度測定，結(jié)果顯示，通過熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒擴(kuò)增曲線(圖5)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖6)計(jì)算得到的病毒滴度為 2.73×1012vg/mL。

1.2.4 T7內(nèi)切酶檢測 細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，收集細(xì)胞提取基因組，嚴(yán)格按照細(xì)胞基因組提取試劑盒說明書進(jìn)行操作。以對應(yīng)基因位點(diǎn)的檢測引物(表1)，用Q5高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，基因組模板量200 ng，具體體系參照說明書。用生工SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收，置于－20℃保存?zhèn)溆?。各?00 ng PCR產(chǎn)物進(jìn)行退火雜交，用T7核酸內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，酶切體系:10×NEB Buffer2 1 μL、模板 200 ng，ddH2O 補(bǔ)足到10 μL，置PCR儀中98℃反應(yīng)3 min后，自然冷卻至40℃，加入 T7 核酸內(nèi)切酶 0.4 μL，37 ℃ 孵育30 min，用PAGE電泳檢測。

1.2.5 測序 將以基因組為模板擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物連接pMD19－T載體，轉(zhuǎn)化XL－10 gold感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，挑取單克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.2 載體構(gòu)建 將sgRNA1、sgRNA2上下游引物(sgRNA1－F:5'－CACCGAAACAATCATTACCATGCCTA－3'， sgRNA1 － R: 5' －AAACTAGGCATGGTAATGATTGTTTC－3';sgRNA2－F:5'－CACCGGAAAGACGGTACAAGGTATAC－3'，sgRNA2－R:5'－AAACGTATACCTTGTACCGTCTTTCC－3') 分別進(jìn)行退火、雜交，體系如下:上、下游引物(20 μmol/L)各 2 μL，ddH2O 6 μL。95 ℃ 水浴 15 min后，自然冷卻至室溫。同時將GV487質(zhì)粒用BsaⅠ酶切，回收線性片段與退火雜交的引物以T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，16℃反應(yīng)過夜。第2天將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化XL－10 gold感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落送生工生物工程(上海)股份有限公司測序驗(yàn)證。測序正確的樣品用QIAGEN中提試劑盒提取質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒分別命名為 MSTN－sgRNA1、MSTN－sgRNA2。

2 結(jié)果與分析

2.1 MSTN基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

以轉(zhuǎn)染后的 293T細(xì)胞基因組為模板，用sgRNA1和sgRNA2檢測引物分別擴(kuò)增MSTN基因編碼區(qū)，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在589 bp和585 bp處分別有1條特異性條帶出現(xiàn)，目的片段大小與預(yù)期結(jié)果相符(圖2)。

在翻譯過程中，譯者吸取了原語內(nèi)容，由于原語和目標(biāo)語及其文化背景的不同，譯者就會不可避免、主觀地作出相應(yīng)的調(diào)整和修改；也就是說，選擇一些合適的翻譯策略來協(xié)調(diào)兩者的差別。首先，譯者必須考慮原作者的寫作意圖，目標(biāo)語形式和目標(biāo)語讀者的接受程度?！拔覀兩踔量梢哉f，沒有創(chuàng)造性叛逆，也就沒有文學(xué)的傳播與接受。……但這僅僅是文學(xué)的創(chuàng)造性叛逆的一個方面，創(chuàng)造性叛逆的更重要的方面還在于它對文學(xué)作品的接受與傳播所起的作用?！盵6]141但是，譯者的有意識誤譯，即譯者所作出的創(chuàng)造性叛逆必須有一個度的限制。

圖2 MSTN基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 T7酶切鑒定基因編輯結(jié)果

T7核酸內(nèi)切酶能夠識別不完全配對的雙鏈DNA并進(jìn)行切割。從圖3可以看出，MSTN－sgRNA1和MSTN－sgRNA2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞僅有sgRNA2位點(diǎn)切出了目的條帶，表明該靶點(diǎn)可能存在堿基突變，sgRNA2位點(diǎn)可作為基因編輯的位點(diǎn)。

圖3 T7酶切鑒定結(jié)果

2.3 測序鑒定編輯效率結(jié)果

天藍(lán)、地綠、水凈、空氣清新是普洱的亮麗名片。作為全國乃至全球生態(tài)環(huán)境最好的地區(qū)之一，普洱是全球北回歸線上保存最完好的綠洲，森林覆蓋率高達(dá)70%，全中國有三分之二的高等物種在此生息相依，生物多樣性和生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)價值高達(dá)7430億元，居云南省第一，全年空氣質(zhì)量優(yōu)良率100%，中心城區(qū)空氣中負(fù)氧離子濃度每立方厘米近2萬個，有的地區(qū)高達(dá)3萬多個，是養(yǎng)生養(yǎng)老的天堂、大健康產(chǎn)業(yè)發(fā)展的圣地，普洱被聯(lián)合國環(huán)境署專家贊譽(yù)為“世界的天堂、天堂的世界”。

Ci,j(φi+1,j+1-φi,j)-Ci-1,j-1(φi,j-φi,j-1)+Di,j(φi+1,j-1-φi,j)-Di-1,j+1(φi,j-φi-1,j+1)

圖4 TA克隆測序結(jié)果

2.4 敲除MSTN基因的重組AAV病毒滴度測定結(jié)果

不管人討厭不討厭，他們穿的衣服總算都市化了。個個都穿著西裝，戴著呢帽，外套都是到膝蓋的地方，腳下很利落清爽。比起我們城里的那種怪樣子的外套，好象大棉袍子似的好看得多了。而且頸間又都束著一條圍巾，那圍巾自然也是全絲全線的花紋。似乎一束起那圍巾來，人就更顯得莊嚴(yán)，漂亮。

圖5 熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

圖6 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 結(jié)論與討論

AAV作為基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的載體較腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒有很多優(yōu)點(diǎn)，如廣泛的宿主細(xì)胞范圍、低免疫原性、長時間在體內(nèi)表達(dá)外源基因等，其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率比常規(guī)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或電轉(zhuǎn)高出1～4個指數(shù)級，可以在多種細(xì)胞類型引入外源基因，并且基因毒性較?。?7-19］，但是其較小的包裝效率(約 4.7 kb)影響了其使用范圍。

本研究以GV487質(zhì)粒作為載體骨架，其所含的SaCas9來自金黃色葡萄球菌，基因長度由經(jīng)典的化膿性鏈球菌Cas9(Streptococcus pyogenes Cas9，SpCas9)的4 200 bp 縮短為 3 200 bp，基因大小減少了 25%［13］，可以被裝載進(jìn)入AAV而不影響AAV的包裝和活力，提供了一個非常方便有效的基因操作工具。

由于家庭部門負(fù)債率的變化對宏觀經(jīng)濟(jì)的影響較為相對復(fù)雜，降低家庭部門負(fù)債率并不一定就有利于經(jīng)濟(jì)增長，還需要綜合考慮其作用機(jī)制，衡量其對經(jīng)濟(jì)正向和反向效應(yīng)的大小，再進(jìn)行最終的判斷。為此，課題組將利用CQMM模型，對家庭部門負(fù)債率變化所可能產(chǎn)生的宏觀經(jīng)濟(jì)影響進(jìn)行反事實(shí)模擬分析，并以此為基礎(chǔ)，結(jié)合外部貿(mào)易危機(jī)的應(yīng)對措施，給出相關(guān)政策建議。

果不其然，第二天王施凱“華麗麗”地感冒了?？上А安〖佟边@種借口用過太多次，老師根本不信，“狼孩子”王施凱只能“挺著病軀”去學(xué)校。

本試驗(yàn)根據(jù)SaCas9的PAM序列NNGRRT設(shè)計(jì)合成靶向MSTN基因的guide RNA序列，成功構(gòu)建載體MSTN－sgRNA1、MSTN－sgRNA2。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，進(jìn)行 T7酶切檢測發(fā)現(xiàn)，MSTN－sgRNA2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞基因組切出了目的條帶，表明該靶點(diǎn)可能存在堿基突變，經(jīng)測序證實(shí)，此位點(diǎn)可作為MSTN基因編輯的位點(diǎn)，為深入研究MSTN的功能奠定了理論基礎(chǔ)，為相關(guān)疾病的基因治療和轉(zhuǎn)基因新品種的研發(fā)提供了新的手段和方法。

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