張昱，袁祖國(guó)，萬(wàn)鵬

（寧波市鄞州人民醫(yī)院，浙江 寧波 315040）

絨毛膜癌是一種高度惡性的腫瘤，繼發(fā)于葡萄胎、流產(chǎn)或足月分娩后。少數(shù)可發(fā)生于異位妊娠后，多為育齡婦女，偶爾發(fā)生于未婚婦女的卵巢，稱為“原發(fā)性絨毛膜癌”。絨毛膜癌約有50%來(lái)自于滋養(yǎng)層細(xì)胞的葡萄胎，25%來(lái)自正常妊娠，25%來(lái)自異常妊娠或者墮胎[1-2]。因此，尋求妊娠絨毛膜癌的新型分子治療的靶點(diǎn)一直是研究的熱點(diǎn)。生存素（survivin）是細(xì)胞抗凋亡基因家族中的最小成員，也是唯一抗凋亡蛋白。它可通過影響Caspase-9活性或抑制Caspase-3的下游細(xì)胞凋亡共同通路抑制凋亡[3]；本研究探討survivin基因?qū)q癌JEG-3細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的分子機(jī)制，從而為臨床上絨毛膜癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；DMEM及0.25%胰酶Trypsin購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；TRIZOL購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；氯仿、酒精（濃度為75%）及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)ABI Applied Biosystems公司；Real-time PCR儀購(gòu)自美國(guó)bio-rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 絨毛膜癌細(xì)胞系JEG-3的培養(yǎng) 以人絨毛膜癌細(xì)胞系JEG-3為實(shí)驗(yàn)材料 （購(gòu)自中科院上海細(xì)胞研究院），經(jīng)離心收集后，以2×104/cm2的密度將其種植于25cm×25cm的培養(yǎng)瓶中。加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，而后將細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 構(gòu)建survivin基因的慢病毒沉默表達(dá)載體shRNA-survivin載體 survivin基因慢病毒干擾shRNA-survivin載體由上海吉?jiǎng)P公司合成，選擇pHBLV-U6-ZsGreen-PGK-Puro作為質(zhì)粒的克隆載體。過表達(dá)載體的克隆切入點(diǎn)是XhoI/BamHI，編號(hào)為ENST00000003569。經(jīng)過基因測(cè)序，從而證明序列的正確性。

1.2.3 絨毛膜癌細(xì)胞的分組與干預(yù)措施 按照不同的處理方法將絨毛膜癌細(xì)胞分成3組，即空白對(duì)照組、空白載體慢病毒對(duì)照組和shRNA-survivin載體慢病毒組。空白對(duì)照組為未做任何處理的細(xì)胞組，空白載體慢病毒對(duì)照組是經(jīng)空白載體的慢病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組，shRNA-survivin載體慢病毒組是由shRNA-survivin載體構(gòu)建的慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞組。以ZsGreen為慢病毒熒光探針，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞慢病毒的轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 三組細(xì)胞融合率達(dá)80%后，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化放入15mL離心管，加入 1mL 的 Trizol RNA iso （Takara，日本），提取總RNA，根據(jù)Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書檢測(cè)總RNA的純度，1.9～2.0為純度良好。逆轉(zhuǎn)錄cDNA保存在4℃冰箱中備用。根據(jù)Takara熒光定量PCR試劑盒的說(shuō)明書要求，采用20μL的反應(yīng)體系，加入各樣品進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。采用FS2000系統(tǒng)對(duì)PCR進(jìn)行分析，反應(yīng)條件預(yù)設(shè)為預(yù)變性：95℃ 30 秒；1 個(gè)循環(huán)。 PCR：95℃ 5 秒；60℃30秒，40個(gè)循環(huán)。溶解曲線：95℃ 5秒；60℃ 1分鐘。降溫：50℃30秒，1個(gè)循環(huán)。內(nèi)參基因GAPDH、survivin、Caspase-3和Caspase-9引物由上海生工公司生產(chǎn)。采用2-△△CT的方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。詳見表1。

表1 目的基因的引物序列

1.2.5 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移 三組細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后收集，按說(shuō)明書要求將基底膜的基質(zhì)原液放在冰箱冷藏（4℃）過夜融化，然后與預(yù)冷無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基按照1:3的比例配置侵襲上室凝膠液體，以每孔55μL的量包被Transwell小室的上室，放置于37℃的孵育箱，2小時(shí)后使上室成膠。再上室每孔接種200μL不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，下室加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液500μL，并將Transwell板放置在37℃的孵育箱中培養(yǎng)24小時(shí)后用結(jié)晶紫染色。最后將Transwell板用倒置光學(xué)顯微鏡拍照，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.6 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖 三組細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后收集，接種在96孔板中，以每孔5000個(gè)/100μL的接種量接種，按照CCK-8試劑盒說(shuō)明書72小時(shí)后每孔加入10μL的CCK-8的試劑，放入37℃的孵育箱中培養(yǎng)2小時(shí)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.2.7 AV-PI試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的凋亡 三組細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后收集，按照AV-PI試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率。流式細(xì)胞儀分析各組樣本，計(jì)算各組凋亡率。Annexin V+/PI-為早期凋亡細(xì)胞，Annexin V+/PI+為晚期凋亡和壞死細(xì)胞，Annexin V-/PI+為正常細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用（±s）表示，多組間采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 shRNA-survivin載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 以綠色熒光蛋白（GFP）為熒光探針，完成survivin沉默表達(dá)的慢病毒載體的構(gòu)建。慢病毒轉(zhuǎn)染效率較高，以人絨毛膜癌細(xì)胞系JEG-3為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，慢病毒轉(zhuǎn)染率如圖1所示。shRNA-survivin載體慢病毒轉(zhuǎn)染滴度為 3×108TU/mL。

2.2 survivin、Caspase-3及 Caspase-9 mRNA 的表達(dá) 與空白對(duì)照組和空白載體慢病毒組比較，shRNA-survivin載體慢病毒組的survivin mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著降低，而Caspase-3的mRNA、Caspase-9的mRNA顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。 詳見表 2。

2.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移 各組透過分子篩的細(xì)胞數(shù)分別為：空白對(duì)照組131.32±18.39，空白載體慢病毒對(duì)照組142.11±14.02，shRNA-survivin載體慢病毒組52.11±4.09。三組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=31.982，P＜0.05），其中 shRNA-survivin載體慢病毒組與空白對(duì)照組、空白載體慢病毒對(duì)照組比較，透過分子篩的細(xì)胞數(shù)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），如圖3所示。

圖1 0.011μL慢病毒轉(zhuǎn)染 JEG-3系效率要高于0.033μL慢病毒，表現(xiàn)為熒光亮度較強(qiáng)。

圖2 三組survivin、Caspase-3及Caspase-9的表達(dá)

圖3 三組透過分子篩的細(xì)胞數(shù)

圖4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞的增殖

2.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞的增殖 各組細(xì)胞的增殖率分別為：空白對(duì)照組（60.34±1.24）%、空白載體慢病毒對(duì)照組 （51.12±2.47）%、shRNA-survivin 載體慢病毒組（24.27±3.11）%。三組細(xì)胞的增殖率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=23.983，P＜0.05），其中，shRNASurvivin載體慢病毒組與空白對(duì)照組、空白載體慢病毒對(duì)照組比較細(xì)胞增殖率顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），如圖 4所示。

圖5 三組的細(xì)胞凋亡率

2.5 AV-PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡的AV-PI結(jié)果 細(xì)胞凋亡率三組分別為：空白對(duì)照組（4.21±1.24）%，空白載體慢病毒對(duì)照組 （3.09±1.13）%，shRNA-survivin載體慢病毒組（35.21±13.31）%，三組凋亡率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F=30.009，P＜0.05）， 其中 shRNA-survivin載體慢病毒組與空白對(duì)照組、與空白載體慢病毒對(duì)照組比較細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），如圖5所示。

3 討論

survivin基因是凋亡抑制蛋白家族（Apoptosis inhibitor protein，AIP）成員中分子量最小的一個(gè)，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)凋亡抑制因子[4-5]。survivin基因在大多數(shù)的腫瘤組織中呈特異性表達(dá)，比如甲狀腺癌[6-7]、膀胱癌[8]、胃癌[9-10]、大腸癌[11-12]、宮頸癌[13]和食道癌[14]。survivin基因的高表達(dá)與腫瘤的復(fù)發(fā)、淋巴浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[14-15]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，survivin基因與絨癌發(fā)生發(fā)展密切[16]。本研究中，作者通過RNAi的方法構(gòu)建shRNA-survivin載體慢病毒轉(zhuǎn)染人絨毛膜癌細(xì)胞系JEG-3細(xì)胞并探究各組中survivin基因的表達(dá)，探討survivin基因的作用，以尋找治療絨癌細(xì)胞的新靶點(diǎn)。

表2 三組survivin、Caspase-3及Caspase-9 mRNA的表達(dá)

Caspases是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一組存在于胞質(zhì)溶膠中的結(jié)構(gòu)上相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶，它們的重要共同點(diǎn)是活性位點(diǎn)都含有半胱氨酸，并特異地?cái)嚅_天冬氨酸殘基后的肽鍵[17]。本研究通過RT-qPCR方法檢測(cè)survivin在人絨毛膜癌細(xì)胞系JEG-3細(xì)胞中凋亡基因Caspase-3和Caspase-9的mRNA水平的表達(dá)。shRNA-survivin載體慢病毒組比空白載體病毒組相比，Caspase-3和Caspase-9的mRNA水平明顯升高 （P＜0.05），可見 shRNA-survivin載體對(duì)人絨毛膜癌細(xì)胞系JEG-3細(xì)胞的凋亡作用非常明顯。

另外，本研究采用Transwell的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的遷移，結(jié)果提示，三組透過分子篩的細(xì)胞數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中shRNA-survivin載體慢病毒組分別與空白對(duì)照組、空白載體慢病毒對(duì)照組比較均顯著降低 （P＜0.05）。故shRNA-survivin在人絨毛膜癌細(xì)胞系JEG-3細(xì)胞的遷移中具有明顯的抑制作用。

本研究還利用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的增殖。三組增殖率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中shRNA-survivin載體慢病毒組分別與空白對(duì)照組、與空白載體慢病毒對(duì)照組比較顯著降低 （P＜0.05），提示shRNA-survivin通過抑制survivin基因的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)人絨毛膜癌細(xì)胞系JEG-3細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用。

最后，本研究利用AV-PI凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的凋亡，三組凋亡率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中 shRNA-survivin 載體慢病毒組分別與空白對(duì)照組、與空白載體慢病毒對(duì)照組比較凋亡率明顯升高（P＜0.05），提示 shRNA-survivin 通過抑制survivin基因的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)人絨毛膜癌細(xì)胞系JEG-3細(xì)胞的過度凋亡具有明顯的促進(jìn)作用。

綜上，shRNA-survivin通過抑制survivin基因的表達(dá)，從而對(duì)絨癌JEG-3細(xì)胞的增殖、遷移有抑制作用，對(duì)人絨毛膜癌細(xì)胞系JEG-3細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用。