鐘翠翠 張義喜 陳桂英

糖尿病是長期危害人類健康的常見慢性病之一，患者長期的體內(nèi)水分流失形成多飲、口干等臨床癥狀，由于長期大量飲水和唾液分泌常導致唾液流速加快、唾液內(nèi)免疫蛋白成分平衡紊亂等現(xiàn)象，長期發(fā)展會并發(fā)唾液腺功能障礙[1-2]。下頜下腺不僅能分泌唾液，其腺體和導管上皮細胞內(nèi)含有多種能表達生物活性的物質(zhì)，同時此類細胞凋亡和增殖的消長可影響腺體分泌功能和組織結(jié)構(gòu)[3]。增殖核細胞抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)是存在于正常增殖細胞或腫瘤細胞內(nèi)的DNA結(jié)合因子，可顯著影響細胞增殖、凋亡[4-5]。成纖維細胞生長因子1(fibroblast grow th factor 1，F(xiàn)GF-1)是成纖維細胞生長因子家族的重要成員，有較強的促增殖作用，能刺激血管生長、加速創(chuàng)傷愈合以及促進神經(jīng)損傷修復[6]。隨著醫(yī)藥研究的深入發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF-1對糖尿病及其并發(fā)癥，如糖尿病性口干等的治療效果較為顯著，但是對于FGF-1作用于糖尿病頜下腺組織的作用機制尚無詳細報道[7]。本項研究通過對FGF-1干預糖尿病患者治療后小鼠臨床指標和頜下腺PCNA功能變化進行觀察，獲得了較為顯著的結(jié)果，現(xiàn)匯報如下。

1.材料與方法

1.1 儀器和藥品 藥物和試劑FGF-1注射液(1000mg/L，純度＞97%。上海高創(chuàng)化學科技有限公司提供，批號17071102)；血糖儀和血糖試紙(上海羅氏診斷產(chǎn)品有限公司)；HE試劑盒(北京索萊寶生物科技公司)；兔抗鼠PCNA一抗和山羊抗兔二抗(sc-2016，Santa Cruz，美國)；生物組織石蠟包埋機(Leica公司，德國)；石蠟切片機(Leica公司，德國)；電子天平(上海天平儀器廠)；超凈工作臺(Thermo公司，美國)；光學顯微鏡(日本Olympus公司BX50型)；離心機(Beckman公司，美國)；-20℃、-80℃冰箱(Thermo公司，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物來源 2型糖尿病雄性C57BL/6 db/db(糖尿病模型小鼠)小鼠20只，體重18-22g，7-9周。血糖＞18.0mmol/L，全部來自于陽谷縣人民醫(yī)院實驗動物生命科學研究組(具有動物培養(yǎng)合格證)。另選10只8周齡的雄性db/m(非糖尿病模型小鼠)小鼠作為對照組。

1.2.2 動物分組方法 對照組小鼠不做處理，正常喂養(yǎng)。隨機數(shù)字表法將20只db/db小鼠平均分為2組，模型組、實驗組(FGF-1組)，每組10只。3組小鼠各項指標組間比較無顯著統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。實驗組小鼠按照2 mg/kg的比例腹腔給藥FGF-1注射液，2次/d，持續(xù)給藥觀察16周。模型和對照組小鼠按照同等劑量的生理鹽水，以同樣腹腔給藥的方式對小鼠進行注射。本研究所有小鼠飼養(yǎng)均選擇動物實驗中心環(huán)境，喂養(yǎng)普通飼料，飲水和喂食均無特殊要求[8]。

1.2.3 基礎(chǔ)指標檢測 觀察血糖和體重指標水平，從給藥觀察開始，每周第七日定時隨機選取每組小鼠采用電子天平稱量體重并準確登記。血糖檢測后取小鼠斷尾后血樣，血糖測定儀校準檢測血糖值。

1.2.4 唾液流率檢測 從給藥觀察開始，每周第七日定時進行唾液流率檢測。根據(jù)小鼠體重計算小鼠麻醉劑量，腹腔給藥10%水合氯醛4m/kg，0.1%毛果蕓香堿0.5mg/kg，等待20min后進行唾液收集。唾液收集取小鼠坐立位，頭向下，將稱量干棉球置于小鼠下頜下腺導管開口處，維持狀態(tài)15min后稱重記錄。唾液流率采用棉球吸收唾液后質(zhì)量減去干棉球質(zhì)量與小鼠體重的比率計算。

1.2.5 HE染色觀察病理 16周，取小鼠進行水合氯醛麻醉，開胸腔，入左心室到主動脈部，開右心耳。生理鹽水沖洗后多聚甲醛灌注固定，取頜下腺組織，固定24h，乙醇濃度梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，連續(xù)切片5μm，進行HE染色并觀察，采用數(shù)碼顯微鏡觀察小鼠頜下腺腺泡和組織情況并拍照，觀察頜下腺、黏膜充血、腺體分泌、黏膜充血以及水腫等情況[9]。

1.2.6免疫組織化學染色檢測各組小鼠頜下腺組織中PCNA的表達[10]石蠟切片常規(guī)脫蠟，用3%雙氧水-甲醇溶液浸泡，室溫避光孵育20min，0.01%枸櫞酸緩沖液高壓鍋內(nèi)加熱煮沸2min，抗原修復。分離抗原修復盒，25℃靜置45min，滴加1%山羊血清35μl，于37℃恒溫箱濕盒內(nèi)孵育30min；用枸櫞酸緩沖溶液洗滌2次后，滴加兔抗鼠PCNA一抗(1∶150)，4℃過夜孵育；用枸櫞酸緩沖溶液洗滌2次后，滴加標記過的山羊抗兔二抗(1∶150)，37℃溫箱濕盒內(nèi)孵育1h；DAB顯色，蘇木素復染、脫水、封片。光鏡觀察免疫組化染色切片，其中PCNA陽性表達細胞內(nèi)可見棕黃色粗顆?；蜃攸S色細顆粒分布。分別從三組選取相同數(shù)目的切片且切片清晰不重疊。計算視野的可見顯色數(shù)目，計算細胞陽性率：細胞陽性率=陽性細胞數(shù)÷視野內(nèi)細胞總數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計學方法 本研究采用統(tǒng)計學軟件SPSS 20.0進行統(tǒng)計學處理，計量資料采用(x±s)表示，進行t檢驗分析，設(shè)P＜0.05時差異有統(tǒng)計學意義，具有可比性。

2.結(jié)果

2.1 基礎(chǔ)指標檢測 通過對小鼠體重和血糖檢測指標可知，實驗組小鼠體重水平從監(jiān)測第4周開始有顯著下降(P＜0.01)，與同期模型組相比均顯著較低(P＜0.01)。實驗組小鼠血糖水平從監(jiān)測第1周開始有顯著下降(P＜0.01)，與同期模型組相比下降有顯著差異(P＜0.01)，從第四周開始，實驗組與對照組相比，無顯著統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。具體檢測結(jié)果如圖1所示：

圖1 基礎(chǔ)指標檢測小鼠體重和血糖

2.2 唾液流率檢測比較 實驗期間實驗組小鼠唾液流率呈遞增趨勢，且在實驗8和16周時唾液流率均顯著高于同時間點模型組(P＜0.05)，但仍均顯著低于同時間點空白對照組(P＜0.05),如表1所示。

表1 三組小鼠唾液流率對比(mg/(min·kg)，x±s，n=10)

2.3 HE染色觀察頜下腺病理情況 HE染色結(jié)果如圖2顯示：實驗組小鼠頜下腺組組織結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯病變，腺泡或?qū)Ч芪s程度與模型組相比顯著減輕；模型組病變嚴重，腺泡間隔增厚，實驗組纖維化病變情況較模型組輕。對照組小鼠下頜下腺組織腺泡飽滿、腺泡間邊界清晰；腺泡細胞呈錐體形且排列密集，細胞質(zhì)染色較淺，細胞核呈圓形，靠近細胞基底部；導管組織中，顆粒曲管較多，管腔較大，管壁由單層柱狀上皮細胞圍成，排列整齊，細胞頂部胞質(zhì)中含大量嗜酸性顆粒。模型組小鼠下頜下腺組織腺泡明顯萎縮，腺泡細胞排列紊亂；導管組織中，顆粒曲管數(shù)目減少，管徑變細，有的甚至失去管腔結(jié)構(gòu)，導管細胞排列呈簇狀堆集，細胞頂部胞質(zhì)中分泌顆粒嗜酸性減弱。

圖2 頜下腺腺泡和導管HE染色(光鏡×400)

2.4免疫組織化學檢測 實驗結(jié)果顯示，3組小鼠頜下腺腺泡細胞及導管細胞中均有PCNA存在，尤以顆粒曲管中表達最強，陽性反應物質(zhì)主要位于腺泡細胞及導管細胞細胞核內(nèi)。對照組、模型組和實驗組小鼠下頜下腺PCNA細胞陽性率依次是(45.23±7.78)、(11.50±1.69)%、(36.98±6.53)%，組間差異有顯著統(tǒng)計學意義(均P＜0.05)，如圖3所示。

圖3 免疫組織化學檢測頜下腺PCNA抗原的表達(光鏡×400倍放大)

3.討論

糖尿病是全球最主要的一種以全身性代謝紊亂為主慢性內(nèi)分泌性疾病，隨著病情的發(fā)展神經(jīng)、腦、眼、心、腎等各部分器官并發(fā)癥和功能障礙尤其嚴重，對患者生活造成很大不良影響，形成了大規(guī)模的社會、醫(yī)療、家庭等規(guī)模性的發(fā)展障礙[11-12]。多飲口干是糖尿病患者主要表現(xiàn)，主要是因為糖尿病患者血糖導致血液滲透壓升高，腎滲透性成尿增多，血容量減少，傳導大腦皮層饑渴反應，形成多飲口干表征[13-14]。長期口干和飲水會激發(fā)口腔唾液分泌和唾液腺組織功能損傷，糖尿病患者口腔唾液腺體比正常人負擔重，其中頜下腺功能退化是顯著表現(xiàn)之一[15-16]。長期唾液分泌工作下，糖尿病患者頜下腺、腮腺等腺體疲勞，尤其腺體積縮小，導致腺體唾液流率降低，影響組織和導管營養(yǎng)平衡，導致蛋白質(zhì)、脂質(zhì)體、糖分等的代謝失調(diào)，使唾液成分和分泌異常。

FGF-1是近年來糖尿病治療藥物應用和關(guān)注較多的優(yōu)勢因子[17]，具有可取代胰島素調(diào)節(jié)血糖的治療地位。有關(guān)胰島素降糖小鼠實驗研究曾經(jīng)報道，胰島素降糖過程對頜下腺細胞增殖和結(jié)構(gòu)變化均有影響。通過這個結(jié)果考慮FGF-1在頜下腺細胞核增殖結(jié)構(gòu)中的作用，研究其在小鼠降糖過程中的基礎(chǔ)指標變化。本研究結(jié)果顯示，實驗組小鼠在體重和血糖水平方面均有顯著改善，減肥和降糖趨勢均有持續(xù)下降到平穩(wěn)發(fā)展?？梢娫谔悄虿≈委熒螰GF-1已經(jīng)有了可以與胰島素相比的藥理意義。

試驗中通過對小鼠頜下腺病理觀察發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠頜下腺萎縮明顯，組織學亦觀察到下頜下腺腺泡明顯萎縮，細胞排列紊亂；顆粒曲管導管數(shù)目減少，管徑變細[18-19]。FGF-1介入治療的糖尿病小鼠下頜下腺腺體及組織學形態(tài)經(jīng)過16周的維持觀察均逐漸趨于平穩(wěn)?？梢奆GF-1對逆轉(zhuǎn)糖尿病型頜下腺功能不良作用。唾液流率檢測結(jié)果中，F(xiàn)GF-1介入治療的糖尿病小鼠唾液流率隨著時間延長而逐步增加，提示FGF-1也可逆轉(zhuǎn)糖尿病導致的下頜下腺功能損傷[20]。糖尿病使頜下腺萎縮的病理機制可能與氧化應激及細胞凋亡相關(guān)。氧化應激是糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素[21]。長期高血糖環(huán)境使頜下腺組織中活性氧產(chǎn)生增加，而抗氧化物質(zhì)不足，機體對氧自由基的清除能力大大減弱，這種動態(tài)失衡引起活性氧有害蓄積，對細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等大分子物質(zhì)造成氧化損傷，從而導致細胞凋亡[22]。

通過本研究對糖尿病小鼠下頜下腺PCNA免疫組織化學檢測表達可知，糖尿病小鼠頜下腺細胞PCNA細胞陽性率顯著下降，而FGF-1給藥組小鼠細胞陽性率顯著高于糖尿病小鼠的細胞表達。這說明糖尿病發(fā)病時小鼠頜下腺腺泡和導管活躍度降低，腺體功能減弱。而FGF-1因子的介入使頜下腺PCNA含量顯著增加，直接產(chǎn)生頜下腺腺體增殖功能加強[23]。FGF-1可通過調(diào)節(jié)血糖緩解氧化應激反應活化磷酸肌醇3激酶和P38靶點，促進分裂原活化蛋白激酶信號通路[24]。與其他類型癌細胞株比較，P38信號通路的的激活可促進AKT、PI3K、mTOR及胞外信號調(diào)節(jié)激酶P38 MAPK等磷酸化。這是細胞內(nèi)外信號傳導和刺激誘發(fā)PCNA細胞表達的直接作用，對增強細胞分裂和增殖具有作用要意義[25]。

4.結(jié)論

通過本研究可知，口腔FGF-1可產(chǎn)生與胰島素相比的降糖效果，對調(diào)節(jié)機體營養(yǎng)代謝和唾液分泌能力具有顯著療效。同時可通過調(diào)節(jié)PCNA的表達實現(xiàn)對糖尿病小鼠頜下腺結(jié)構(gòu)萎縮功能退化的逆轉(zhuǎn)效果。

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