關(guān)曉月 錢 華 關(guān)永暉 古麗努爾·阿吾提

根尖周炎是口腔疾病中常見的細(xì)菌感染性疾病，多繼發(fā)于齲病及牙髓病，其病理主要表現(xiàn)為根尖周病變區(qū)牙槽骨炎性破壞[1]。高遷移率族蛋白盒1(high mobility group box 1,HMGB1)是一種非組蛋白染色體蛋白，廣泛分布于真核細(xì)胞的細(xì)胞核中，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、基因轉(zhuǎn)錄等[2]。HMGB1作為一種重要的晚期炎性介質(zhì)，對(duì)維持和延長(zhǎng)機(jī)體內(nèi)炎癥反應(yīng)有重要的作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞受到內(nèi)毒素(Lipopolysaccharide,LPS)刺激，可分泌產(chǎn)生有活性的HMGB1，并促其發(fā)揮炎癥細(xì)胞因子的作用[4]。HMGB1可少量表達(dá)于正常根尖周組織，然而，在炎癥根尖周組織中HMGB1的表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性[5]。雌激素對(duì)全身骨代謝起著重要作用，雌激素能夠刺激成骨細(xì)胞制造骨基質(zhì)；當(dāng)體內(nèi)雌激素水平降低時(shí)，破骨細(xì)胞的數(shù)量增多，活性增強(qiáng)，促進(jìn)骨吸收。雌激素缺乏時(shí)，可加劇大鼠根尖周炎病變區(qū)炎性骨吸收[6]。近年來，有研究顯示，雌激素水平的改變可影響HMGB1的表達(dá)[7-9]。然而，當(dāng)雌激素缺乏時(shí)，大鼠根尖周炎病變區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及骨破壞程度的加劇，是否與HMGB1的表達(dá)變化相關(guān)，目前尚未可知。本次實(shí)驗(yàn)擬通過建立卵巢去勢(shì)大鼠根尖周炎模型，觀察雌激素缺乏對(duì)大鼠根尖周炎模型中HMGB1表達(dá)的影響。

1.材料及方法

1.1 材料購(gòu)置40只12-16周齡，體重200g-220g的健康雌性SD大鼠，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(新)2015-0002。將大鼠隨機(jī)分為兩組，OVX組及SHAM組，每組20只。主要試劑：戊巴比妥鈉(Sigma,美國(guó))，Trap試劑盒(Sigma,美國(guó)),HMGB1兔抗鼠多克隆抗體(Abcam,美國(guó)),二抗SP試劑盒及DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 卵巢摘除術(shù)所購(gòu)置大鼠于同等環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。在兩名助手幫助下，向大鼠腹腔內(nèi)推入0.3%(3ml/kg)戊巴比妥鈉行全身麻醉，大鼠取仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)，在腰肌與肋緣相交處備皮，常規(guī)消毒，縱向切開組織、切除卵巢，徹底止血，縫合。SHAM組僅切除卵巢周圍附著的卵巢大小脂肪組織，常規(guī)消炎，關(guān)閉腹腔。給予術(shù)后護(hù)理，定期補(bǔ)給飲用水及鼠糧，每日更換墊料。

1.2.2 根尖周炎模型制備及樣本處理

卵巢摘除術(shù)后一周[10]，行根尖周炎模型制備，麻醉方法同上。大鼠取仰臥位，固定四肢及上頜。使用1/2#球鉆對(duì)雙側(cè)下頜第一磨牙遠(yuǎn)中窩處開髓，探及穿髓點(diǎn)后即停止，防止底穿，隨后將髓腔直接暴露于口腔環(huán)境中。髓腔開放后0d、7d、14d、21d時(shí)，OVX組及SHAM組均隨機(jī)挑選5只大鼠，全麻下內(nèi)眥靜脈取血3-5ml，分離下頜骨，脫頸處死。修整下頜骨并清理后，10%EDTA 4℃下緩慢脫鈣。二甲苯浸泡，常規(guī)梯度酒精脫水，正丁醇透明，石蠟包埋。對(duì)標(biāo)本行頰舌向連續(xù)切片，切片厚約5um,以切至第一磨牙遠(yuǎn)中根根尖孔為標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)包含下頜第一磨牙遠(yuǎn)中根尖孔的切片行HE染色、酶組織化學(xué)染色、免疫組織化學(xué)染色并分析結(jié)果。

1.2.3 血清雌激素水平檢測(cè) 大鼠腹內(nèi)眥靜脈血置入2ml EP管，4℃下，1000r/min離心20min,分離血清，放射免疫法檢測(cè)血清中雌激素水平。

1.2.4 HE染色 組織學(xué)染色時(shí)，OVX組及SHAM組于0d、7d、14d、21d時(shí)，各選取3個(gè)樣本，每樣本隨機(jī)選取3張切片行常規(guī)HE染色，光鏡下觀察根尖周骨骨破壞范圍及炎性浸潤(rùn)程度。

1.2.5 酶組織化學(xué)染色 抗酒石酸酸性磷酸酶(Trap)是破骨細(xì)胞特異的生化標(biāo)志物[11]。各實(shí)驗(yàn)分組于0d、7d、14d、21d隨機(jī)挑選出三個(gè)樣本。將所選標(biāo)本置于60℃溫箱烤片1h，蒸餾水預(yù)熱，二甲苯I,II脫蠟，下行梯度酒精脫水，37℃下Trap染液孵育1h，蘇木素染色，細(xì)胞核返藍(lán)，封片。光鏡下觀察破骨細(xì)胞形態(tài)及數(shù)目。陰性對(duì)照使用PBS。

1.2.6 免疫組織化學(xué)染色及分析 各實(shí)驗(yàn)分組于0d、7d、14d、21d隨機(jī)挑選出三個(gè)樣本。各樣本置于二甲苯中常規(guī)脫蠟，梯度酒精入水，37℃下胃蛋白酶消化20min,消除內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗5min×3次，血清封閉，滴加一抗，HMGB1兔抗鼠多克隆抗體 (1∶500)，4℃過夜。滴加二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。陰性對(duì)照以PBS代替一抗。

1.2.7 細(xì)胞計(jì)數(shù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 OVX組及SHAM組大鼠血清雌激素水平采用Graphpad軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)于Trap染色及免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，采用雙盲法在高倍視野下(400×)隨機(jī)選取根尖周病變區(qū)的5個(gè)視野對(duì)破骨細(xì)胞及HMGB1陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值。數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組間比較采用方差分析和t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。

2.結(jié)果

2.1 血清雌激素水平 SHAM組血清雌激素水平在實(shí)驗(yàn)全程中處于較為穩(wěn)定，無明顯改變(-39.89±6.72pg/mL)；行雙側(cè)卵巢切除術(shù)的OVX組，術(shù)后第7d血清雌激素水平急劇降低，14d及21d時(shí)OVX組血清雌激素水平較7d組無明顯差異，穩(wěn)定保持在較低水平(-10.36pg±2.10pg/mL)。

2.2 組織學(xué)觀察 HE染色可觀察大鼠實(shí)驗(yàn)性根尖周炎模型病變區(qū)骨缺損范圍及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)狀態(tài)。本次實(shí)驗(yàn)中，髓腔開放0d時(shí)，大鼠下頜第一磨牙根尖周組織結(jié)構(gòu)完整，無炎性吸收及骨破壞。髓腔開放7d時(shí)，兩組模型根尖周組織可見以中性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，牙槽骨輕度吸收呈蟲蝕狀。髓腔開放14d時(shí)，兩實(shí)驗(yàn)組下頜第一磨牙牙髓組織基本全部壞死，根尖周病變區(qū)多種炎性細(xì)胞浸潤(rùn)加重，牙槽骨吸收較7d時(shí)進(jìn)一步加重。髓腔開放后21d時(shí)，根尖周病變區(qū)炎癥進(jìn)一步增強(qiáng)，出現(xiàn)以淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞大面積浸潤(rùn)，形成根尖膿腫，牙槽骨吸收于此時(shí)達(dá)到最大值。本實(shí)驗(yàn)中，OVX組大鼠開髓后7d,14d及21d，其根尖周組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度及牙槽骨破壞范圍均較SHAM組顯著(圖1)。

圖1 根尖周組織HE染色及酶組織化學(xué)染色結(jié)果

2.3 酶組織化學(xué)染色結(jié)果 Trap陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)呈深紅色/紫色，胞核呈藍(lán)色。在Trap染色中具有兩個(gè)或兩個(gè)以上細(xì)胞核的陽(yáng)性細(xì)胞即為破骨細(xì)胞。Trap染色結(jié)果顯示，破骨細(xì)胞多分布于根尖周炎病變區(qū)骨破壞前沿。兩組大鼠開髓后0d,7d,14d及21d時(shí)，其根尖周病變區(qū)均可見破骨細(xì)胞的表達(dá)。破骨細(xì)胞數(shù)目自開髓后0-14d逐漸增多，并于14d時(shí)達(dá)到頂峰，21d時(shí)其數(shù)目發(fā)生減少。模型建立后0d，7d及14d時(shí)，OVX組破骨細(xì)胞數(shù)目較SHAM組增加顯著(P＜0.05)(見圖2)。

圖2 根尖周組織酶組織化學(xué)染色結(jié)果

2.4 HMGB1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，髓腔開放后0d，OVX組及SHAM組大鼠根尖周組織中均可少量表達(dá)HMGB1，且HMGB1主要分布于細(xì)胞核內(nèi)，輕微表達(dá)于細(xì)胞胞漿。大鼠髓腔開放后7d，HMGB1胞核著色的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)數(shù)目增加，且細(xì)胞胞漿對(duì)于HMGB1的陽(yáng)性表達(dá)顯著升高。開髓后14d,21d時(shí)，兩組大鼠根尖周炎病變區(qū)胞核著色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較7d時(shí)減少,但胞漿HMGB1陽(yáng)性著色持續(xù)增多，且于21d時(shí)胞漿呈HMGB1陽(yáng)性著色的細(xì)胞數(shù)目達(dá)到最大值。自根尖周炎模型建立起的7d,14d,21d,OVX組大鼠根尖周炎病變區(qū)HMGB1胞漿著色的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著高于SHAM組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見圖 3)。

圖3 根尖周組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×400)

3.討論

雌激素在全身骨代謝的過程中發(fā)揮了重要作用,雌激素的缺乏可通過調(diào)控IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-11,M-CSF,Prostaglandin E(PGE)等細(xì)胞因子促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成，促進(jìn)骨吸收[12-15]。本次試驗(yàn)對(duì)OVX組進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除，通過測(cè)量OVX組及SHAM組大鼠血清雌激素水平，判定成功建立大鼠雌激素缺乏模型，OVX組血清雌激素水平約為(-10.36pg±2.10pg/mL),SHAM組約為(-39.89±6.72pg/mL)。組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，隨時(shí)間推移，OVX組根尖周組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及骨破壞面積均較SHAM組顯著。另外，酶組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，血清雌激素水平的降低，可促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成及功能行使，大鼠開髓后0d、7d、14d時(shí)，OVX組根尖周組織破骨細(xì)胞數(shù)目明顯多于SHAM組(P＜0.05)。以上結(jié)果與Zhang et al.關(guān)于雌激素缺乏對(duì)大鼠根尖周炎的作用的描述相一致[16]。

HMGB1作為一種DNA伴隨因子存在于多種真核細(xì)胞的細(xì)胞核中，當(dāng)機(jī)體發(fā)生細(xì)胞損傷、壞死及炎癥時(shí)，HMGB1可從細(xì)胞核中脫離進(jìn)入胞質(zhì)中，發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[18]。HMGB1與多種促炎因子之間存在相互影響，如采用LPS，IL-1β、TNF-α刺激巨噬細(xì)胞及單核細(xì)胞時(shí)，可促進(jìn)HMGB1的產(chǎn)生，而當(dāng)使用HMGB1刺激巨噬細(xì)胞及單核細(xì)胞，亦可加強(qiáng)IL-1β、IL-6、TNF-α的產(chǎn)生[3,4]。此外,HMGB1的產(chǎn)生及分泌與骨組織改建存在一定聯(lián)系，破骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞中均可檢測(cè)到HMGB1的表達(dá)[19]。研究人員證實(shí)，HMGB1不僅可通過結(jié)合RANKL DNA序列上調(diào)TNF-α轉(zhuǎn)錄，另外亦促使低于閾值濃度的RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成[20,21]。根尖周炎作為口腔常見炎性骨吸收疾病，HMGB1參與了其發(fā)生發(fā)展過程[5,22]。本文通過免疫組織化學(xué)染色觀察HMGB1在大鼠根尖周炎病變區(qū)的表達(dá)，SHAM組大鼠根尖周炎病變區(qū)HMGB1的表達(dá)結(jié)果與賈彤彤等一致[22]，即自開髓后0-21d，大鼠根尖周胞質(zhì)染色的HMGB1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸增加，于21d時(shí)達(dá)到最大值。OVX組大鼠于髓腔暴露后7d、14d及21d時(shí)，其根尖周HMGB1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較SHAM組明顯增高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，本研究證實(shí)雌激素缺乏可增強(qiáng)大鼠根尖周病變區(qū)HMGB1的表達(dá)。

雌激素對(duì)于HMGB1的作用已在研究中得以探討，Gonda等[23]發(fā)現(xiàn)HMGB1可通過與雌激素受體的結(jié)合，增強(qiáng)雌激素效應(yīng)。此外，使用雌激素刺激雌激素敏感細(xì)胞時(shí)，可觀察到其細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)分布異常，同時(shí)伴有HMGB1的高表達(dá)[7,8]。本文僅通過免疫組織化學(xué)染色證實(shí)雌激素缺乏可影響大鼠根尖周炎病變區(qū)HMGB1的表達(dá)，未說明雌激素缺乏是通過何種途徑調(diào)控HMGB1的表達(dá)。此外，大鼠根尖周炎病變區(qū)HMGB1表達(dá)與其它炎性因子，如TNF-α,IL-1β及IL-6等之間的交互作用亦未得到開展研究。

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