劉娜 張賢華 李影 張維 楊坤 顧斌

隨著增齡的變化，人體多種重要器官由于干細胞維持組織平衡能力下降，出現(xiàn)衰老相關(guān)疾病表現(xiàn)，與人體大部分組織器官一樣，骨具有發(fā)育、增齡、衰老的過程和受損后的再生能力，骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是骨組織代謝或骨改建的重要細胞學(xué)基礎(chǔ)[1]。在骨發(fā)育、衰老和再生修復(fù)中干細胞起到了主導(dǎo)作用，同時干細胞的各項功能受到嚴密的分子調(diào)控，這些調(diào)控因素不僅是維持骨生理性功能活動的基礎(chǔ)，而且是決定病理狀態(tài)產(chǎn)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的機制。

經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號在骨骼的發(fā)育和代謝方面有重要作用。近年來的研究提示，Wnt信號通路與干細胞的增齡變化有密切關(guān)系，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號通路對骨髓間充質(zhì)干細胞的衰老發(fā)揮重要調(diào)控作用[2]，也有研究表明Wnt/β-catenin信號通路可以通過促進細胞產(chǎn)生ROS進而誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞的衰老[3]。除此之外，機體的生理、病理狀態(tài)發(fā)生改變會改變干細胞所處的微環(huán)境，進而影響干細胞內(nèi)Wnt信號通路的活化水平[4-7]。本研究采用不同年齡大鼠來源骨髓間充質(zhì)干細胞結(jié)合Wnt/β-catenin信號通路來探討增齡因素導(dǎo)致的體內(nèi)環(huán)境改變對間充質(zhì)干細胞的影響。

1.材料方法

1.1 材料 胎牛血清，L-DMEM培養(yǎng)基(Gibco BRL)；0.25%胰蛋白酶(Sigma,St Louis,MO,美國)；青鏈霉素(Gibco BRL)；鏈霉素(Gibco BRL)；實時定量PCR儀(Applied Biosystems 7500，美國Life Technologies公司)；RNA抽提試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas，美國)；Taq DNA聚合酶、dNTPs和引物上海生物工程公司(中國)；Syber Green熒光定量PCR檢測試劑盒(Takara，日本)；衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒，Westen及IP裂解液，核蛋白提取液，BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天公司，中國)；IL-6、TNF-αELISA檢測試劑盒(R&DSystems，美國)；β-catenin(Abcam，美國)；β-Act in，羊抗兔IgG(中杉金橋，中國)。

1.2 實驗動物 3月齡級18月齡SD大鼠共16只，均為雄性大鼠，每組各8只，平均體重(590±17)g，由北京維通利華實驗動物有限責(zé)任公司提供。各月齡實驗動物適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，兩組實驗動物處死，取雙側(cè)股骨，每個樣本取單側(cè)股骨-80℃冰箱保存待查，另一側(cè)股骨進行細胞培養(yǎng)。

1.3 骨密度測定 采用Discovery Wi(Hologic，美國)雙能X線骨密度儀對實驗動物的股骨樣本進行骨密度測定。首先將骨組織樣本放置在骨密度儀探頭下，應(yīng)用動物骨密度測定軟件，自動分析出大鼠股骨的骨密度。

1.4 骨髓間充質(zhì)干細胞的體外培養(yǎng) 骨髓間充質(zhì)干細胞的體外培養(yǎng)及鑒定遵循本實驗室前期的實驗步驟[6]。3月齡及18月齡SD大鼠各8只，脫頸處死，消毒后取下股骨，無菌去除骨組織周圍肌肉及筋膜等軟組織，暴露骨髓腔。用注射器吸取L-DMEM培養(yǎng)基，反復(fù)沖洗骨髓腔，將所得懸液以1500r/min離心5min。重懸細胞，加入培養(yǎng)基(90%L-DMEM和10%胎牛血清)，放入37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，48h后半量換液，3d后鋪滿瓶底80%時傳代。采用低密度稀釋法擴增培養(yǎng)獲取BMSCs,取3-4代細胞進行實驗。

1.5 衰老β-半乳糖苷酶染色(SA-β-Gal染色) 將純化獲取的P3代BMSCs制成單細胞懸液，以5×104個／mL的密度接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)至細胞融合達50%。按衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒檢測說明首先將細胞用β-半乳糖苷酶固定劑固定10min，PBS洗滌三次(每次3min)后，隨后用新鮮制備的β-半乳糖苷酶的染色工作液對細胞進行染色，37℃放置12h，隨機選擇10個微觀領(lǐng)域的陽性染色細胞計數(shù)。

1.6 細胞因子酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA檢測)將P3代BMSCs按1×105個/mL的密度接種到24孔板中，每孔800ul，每組設(shè)3個復(fù)孔。待細胞貼壁后，棄原培養(yǎng)液，PBS沖洗1遍，換新鮮的L-DMEM(10%FBS)進行常規(guī)培養(yǎng)，72h后收集各個培養(yǎng)孔內(nèi)的培養(yǎng)液，離心后取上清液進行ELISA檢測。按照TNF-α、IL-6 ELISA檢測試劑盒說明建立標(biāo)準(zhǔn)曲線后每孔加入待測樣品100μl，洗板，每孔加入一抗工作液50μl反應(yīng)板充分混勻后置于37℃60min，洗板，加入酶標(biāo)抗體工作液100μl反應(yīng)板充分混勻后置于37℃60min，洗板后加入底物液100μl，置于37℃避光反應(yīng)10min，最后每孔加入50μl終止液混勻，在450nm處測吸光值。

1.7 Western blotting檢測BMSCs中的蛋白表達 將P4代3月齡及18月齡BMSCs以2×105個/mL的密度接種于直徑9cm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)72h細胞密度達70%，在預(yù)冷的PBS中清洗3遍，采用細胞裂解液試劑盒分別提取各組標(biāo)本中的總蛋白，另外根據(jù)實際說明應(yīng)用細胞核蛋白、細胞漿蛋白抽提試劑盒分離提取BMSCs細胞核蛋白。采用BCA法測定蛋白樣本濃度，沸水煮5min，12000r/min離心1min，制備蛋白樣品，－20℃保存。配置8%的分離膠、6%的濃縮膠和1×SDS電泳液，依據(jù)蛋白定量結(jié)果進行蛋白上樣，電壓為80V，電泳20min，待溴酚藍進入分離膠后調(diào)整電壓至 120V，電泳 60min。在轉(zhuǎn)移電泳槽(200mA，2h)中將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluorid，PVDF)膜，用 TBST配制的含有5%脫脂奶粉的封閉緩沖液封閉2h，PVDF膜封閉β-catenin(1∶800)，4℃過夜。次日取出封有一抗的PVDF膜，用TBST洗膜，每次5min，共計3次。按說明書加入1∶1000工作濃度的二抗，室溫條件下封閉2h。TBST洗脫二抗，每次10min，共計3次。漂洗膜后加入電化學(xué)發(fā)光底物發(fā)光顯色試劑盒顯色，采用蛋白凝膠成像系統(tǒng)照相觀察。

1.8 實時定量PCR 檢測BMSCs基因表達將2組P4代BMSCs以1×105個/mL的密度接種至T25培養(yǎng)瓶，待細胞貼壁后PBS沖洗兩遍，隨后換液進行常規(guī)培養(yǎng)，72h后用Trizol裂解并提取總RNA，測定RNA濃度，分別逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用Sybr Green試劑盒進行熒光定量PCR檢測，目的基因及管家基因在不同的反應(yīng)管中進行擴增，反應(yīng)體系均為20μl。引物序列：TERT：Forw ard 5’-CTAGCATCCTGCTGCTACGC-3’，Reverse 5’-AGGGGACAGGGTTAGTCCAA-3’； LEF-1：Forward 5’-TCAGGCAAGCCTACCCATCTTC-3’，Reverse5’-GGGTGCTCCTGTTTGACCTGA-3’；TCF-4：Forward 5’-TCCCAGTACTACC CATATTCCAGCA-3’，Reverse 5’-AGTCCCTG TTGTAGTCGGCAGTG-3’；β-Actin：Forward 5’-GGGTCCTCTGTGAACTTGCTC-3’，Reverse 5’-TGTAATCCTGTGGCTTGTCCTC-3’。反應(yīng)條件：95℃變性20min，95℃30s，60℃1min，40個循環(huán)。采用實時熒光定量PCR儀監(jiān)測記錄數(shù)據(jù)，結(jié)果根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線由軟件自動計算后得出。驗證該方法的重復(fù)性和擴增效率。本實驗重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；進行多組間比較時，P值進行Bonferroni校正。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 大鼠股骨密度測定結(jié)果 雙能X線檢測結(jié)果顯示隨著年齡的增殖大鼠股骨密度顯著降低。我們所檢測的3月齡雄性大鼠股骨密度為0.394±0.0491g/cm2,18月齡雄性大鼠股骨密度為0.2540±0.0437g/cm2，其顯著低于3月齡組(P＜0.05，圖1)。

圖1 大鼠股骨密度檢測(*P＜0.05)

2.2 SA-β-Gal染色檢測BMSCs增齡性變化將3月齡及18月齡大鼠BMSCs均勻接種，常規(guī)培養(yǎng)待細胞密度達到80%后進行SA-β-Gal染色。鏡下觀察細胞形態(tài)為長梭形，胞突略短，胞漿飽滿，細胞狀態(tài)良好。此外，2組均可見BMSCs成功染色，淺藍色為陽性，3月齡組少數(shù)細胞染色陽性，18月齡組細胞染色陽性數(shù)目較多(圖2A)。隨后我們將染色后細胞進行顯微鏡下計數(shù)，統(tǒng)計染色陽性細胞百分比，經(jīng)10個視野的綜合統(tǒng)計分析可見18月齡BMSCs SA-β-Gal染色陽性率高達37.902%，顯著高于3月齡組BMSCs(P＜0.05，圖2B)。為了進一步驗證BMSCs的衰老程度，我們從基因水平檢測了TERT的表達，結(jié)果顯示18月齡BMSCs表達量顯著低于3月齡組(P＜0.05，圖2C)。

圖2 3月齡及18月齡BMSCs SA-β-gal染色結(jié)果及TERT mRNA的相對表達量

2.3 增齡因素對BMSCs炎癥因子分泌量的影響 將3月齡及18月齡大鼠P3代BMSCs種到24孔板中，細胞貼壁72小時候提取細胞上清液進行ELISA檢測。在提取的細胞外基質(zhì)中均檢測到了炎癥因子TNF-α及IL-6。檢測結(jié)果顯示18月齡大鼠BMSCs所分泌的TNF-α(P＜0.05，圖3A)及IL-6(P＜0.05，圖3B)均顯著高于3月齡BMSCs的炎癥細胞因子分泌量。

圖3 3月齡及18月齡大鼠BMSCs培養(yǎng)液中炎癥因子TNF-α及IL-6的分泌量

2.4 增齡因素對大鼠BMSCs Wnt/β-catenin信號通路的影響 由于Wnt信號通路骨發(fā)育及骨再生中發(fā)揮重要作用，在上述實驗的基礎(chǔ)上我們對經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)鍵蛋白及基因進行檢測。首先我們分離提取3月齡及18月齡BMSCs的全細胞蛋白并進一步分離提取了細胞核蛋白。分別將3月齡及18月齡BMSCs的全細胞蛋白及細胞核蛋白進行Western Blot檢測，檢測結(jié)果顯示18月齡BMSCs無論全細胞蛋白還是細胞核蛋白的表達量均高于3月齡BMSCs組(圖4A)。Real Time PCR檢測結(jié)果顯示W(wǎng)nt通路關(guān)鍵基因LEF-1及TCF-4在18月齡大鼠BMSCs中的表達顯著高于3月齡BMSCs組(P＜0.05，圖4B)。

圖4 3月齡及18月齡大鼠BMSCs常規(guī)培養(yǎng)72h后β-catenin蛋白的表達量及LEF-1、TCF-4 mRNA的相對表達量

3.討論

干細胞在機體中處于一種平衡狀態(tài)，但是隨年齡的增長，干細胞的功能受到一定影響，其平衡遭到破壞。機體增齡過程中，間充質(zhì)干細胞的自我調(diào)節(jié)機制發(fā)生改變，從而使其某些生物學(xué)性狀不再穩(wěn)定，主要表現(xiàn)為自身抵抗力的降低及其對外界環(huán)境刺激的反應(yīng)能力的降低。骨髓間充質(zhì)干細胞在骨骼發(fā)育和重建過程中發(fā)揮著重要作用，前期有文獻報道隨著小鼠年齡的增加BMSCs的增殖能力及成骨分化能力均受顯著抑制[8]。另有研究表明骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖能力隨著年齡增長或分裂次數(shù)的增加而下降，來自老年供體的間充質(zhì)干細胞的增殖能力和抗凋亡能力均低于年輕供體來源的細胞[9]。

由于前期研究證實長期體外培養(yǎng)后間充質(zhì)干細胞可能在基因表達、增殖和分化能力等方面發(fā)生變化甚至發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化[10]，因此，本研究采用的是收集不同年齡階段大鼠的股骨骨髓進行骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)，在此基礎(chǔ)上進行增齡因素對大鼠BMSCs的影響及可能的機制。首先我們通過對實驗動物的檢測發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增殖大鼠股骨密度顯著降低，在此基礎(chǔ)上我們再進一步進行干細胞衰老情況的鑒定。SA-β-Gal是被廣泛認可的經(jīng)典細胞衰老標(biāo)記物之一[11]，因此我們應(yīng)用衰老相關(guān)β半乳糖苷酶染色試劑盒對兩組BMSCs的SA-β-Gal的表達水平進行檢測，染色結(jié)果顯示兩組BMSCs均有藍色沉淀形成，但是18月齡組BMSCs藍色沉淀的數(shù)量、面積等顯著高于3月齡組，這也與前期的報道一致[11]。端粒相對長度和端粒酶活性也是細胞增齡和衰老的重要指標(biāo)，端粒酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，由RNA和蛋白質(zhì)組成，是以自身RNA為模板，合成端粒重復(fù)序列，加到新合成DNA鏈末端。因此，細胞每有絲分裂一次，就丟失一段端粒序列，當(dāng)端粒長度縮短至一定程度，細胞停止分裂導(dǎo)致衰老與死亡。端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)起源于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，在其他輔助酶作用下利用RNA合成DNA，TERT是端粒酶起作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)和主要調(diào)控亞單位，可通過逆轉(zhuǎn)錄端粒酶R NA模板序列，合成端粒DNA重復(fù)序列并添加到染色體末端，從而延長端粒長度[12]。本課題應(yīng)用 qRT-PCR對兩組BMSCs的端粒酶mRNA表達水平進行相關(guān)檢測。結(jié)果顯示18月齡BMSCs TERT表達量顯著低于3月齡BMSCs組。

前期研究表明隨著年齡的增長，機體功能在逐漸發(fā)生變化，當(dāng)增齡性變化達到衰老程度時，天然免疫被激活并產(chǎn)生促炎介質(zhì)，炎癥因子的水平會呈現(xiàn)不同程度的升高[13]。近期研究證實衰老與炎癥是相互作用的，衰老過程常伴隨炎癥穩(wěn)態(tài)失衡，而炎癥又可導(dǎo)致衰老的發(fā)生發(fā)展[14]。我們通過將3月齡及18月齡大鼠BMSCs所分泌的TNF-α及IL-6進行對比，結(jié)果證實隨著年齡的增長BMSCs所分泌的細胞因子的水平顯著增高，這些結(jié)果與前期研究結(jié)果一致，表明增齡性變化會引起機體免疫水平的改變，使其炎癥因子表達增高進而使機體各器官產(chǎn)生衰老相關(guān)表型。在增齡性骨代謝過程中骨質(zhì)及骨量都會隨著年齡的增加而減少，炎癥因子水平的升高會直接影響骨髓腔的微環(huán)境，TNF-α及IL-6水平的長期持續(xù)增高可以導(dǎo)致干細胞成骨分化能力的降低，并抑制干細胞的骨再生潛能。闡明增齡性骨代謝異常的作用機制并探尋增強增齡性BMSCs成骨分化能力是近期研究的熱點。

Wnt家族蛋白是體內(nèi)一類重要的調(diào)節(jié)蛋白，參與機體生長發(fā)育、干細胞自我更新及腫瘤發(fā)展過程，同時在維持骨穩(wěn)態(tài)中也起到重要作用。有文獻報道Wnt3a+/-雄性小鼠骨質(zhì)含量較正常下降[15]。另有研究表明Wnt經(jīng)典信號通路抑制成骨作用的原因是成骨細胞的轉(zhuǎn)錄因子的表達水平降低以及抑制在成骨過程中發(fā)揮重要作用的c-JNK以及P38MAPK，Wnt經(jīng)典信號通路的高表達能夠抑制hMSC形成新生骨[16]。在骨髓微環(huán)境中，β-catenin需要長期的表達來維護原始造血細胞的能力[17]。本研究中我們分別提取了3月齡及18月齡大鼠BMSCs的全細胞蛋白及細胞核蛋白，我們的實驗結(jié)果表明，隨著年齡的增加細胞核內(nèi)的β-catenin聚積量顯著增高，全細胞蛋白中的β-catenin表達水平也呈上升趨勢，這提示W(wǎng)nt經(jīng)典信號通路的激活是增齡性骨代謝異常的重要因素。另外，經(jīng)典Wnt通路通過轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF和FOXO與β-catenin特異性關(guān)聯(lián)從而影響老化過程。這些轉(zhuǎn)錄因子的胞內(nèi)水平以及它們在核內(nèi)的定位與細胞老化密切相關(guān)。細胞內(nèi)不同的wnt通路水平調(diào)控著老化過程。當(dāng)β-catenin與TCF/LEF結(jié)合時，可以減緩老化；當(dāng)β-catenin與FOXO結(jié)合時，可以加速細胞衰老[18]。此外，已經(jīng)進入到細胞核內(nèi)的β-catenin與 TCF/LEF結(jié)合后可啟動 Runx2、c-myc、cyclinD等靶基因，促使細胞進入S期，進而促進成骨細胞的分化、發(fā)育與成熟。本研究的qRT-PCR結(jié)果顯示，18月齡組BMSCs隨著細胞核內(nèi)β-catenin聚積量增高Wnt經(jīng)典信號通路被激活，細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子LEF-1、TCF-4的表達水平顯著增高，這兩種轉(zhuǎn)錄因子的增高會影響B(tài)MSCs的增殖能力。

本研究通過對比研究不同年齡階段BMSCs的炎癥細胞因子分泌水平及Wnt經(jīng)典信號通路關(guān)鍵基因及蛋白的變化，探索增齡因素影響下BMSCs生物學(xué)行為異常的發(fā)生機制。在機體的增齡至衰老過程中其表觀遺傳的變化，如干細胞數(shù)量的變化、自我更新及增殖能力的變化、多項分化潛能的變化對其有一定的影響，在這個過程中干細胞所處的微環(huán)境變化發(fā)揮同樣重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長機體的炎癥因子表達水平會有所增高，這也是干細胞功能變化的重要干擾因素，此外還發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號通路在此過程中發(fā)生明顯變化，基于此后期我們將系統(tǒng)研究增齡導(dǎo)致干細胞功能變化的作用機制，為提高增齡條件下干細胞增殖及成骨分化能力提供理論依據(jù)。

[1]Polymeri A,Giannobile WV,Kaigler D.Bone Marrow Stromal Stem Cells in Tissue Engineering and Regenerative Medicine[J].Horm Metab Res,2016,48(11):700-713

[2]Gu Z,Tan W,Feng G,et al.Wnt/β-catenin signaling mediatesthesenescenceof bonemarrow-mesenchymal stem cells from systemic lupuserythematosuspatients through thep53/p21 pathw ay[J].Mol Cell Biochem,2014,387(1-2):27-37

[3] Zhang DY,Pan Y,Zhang C,et al.Wnt/β-catenin signaling induces the aging of mesenchymal stem cells through promoting the ROSproduction[J].Mol Cell Biochem,2013,374(1-2):13-20

[4] Li X,Liu N,Wang Y,et al.Brain and muscle aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like protein-1 cooperatesw ith glycogen synthasekinase-3βto regulateosteogenesis of bone-marrow mesenchymal stem cells in type 2 diabetes[J].Mol Cell Endocrinol,2017,440:93-105

[5] Liu W,Qi M,Konermann A,et al.The p53/miR-17/Smurf1 pathw ay mediates skeletal deformities in an age-related model via inhibiting the function of mesenchymal stem cells[J].Aging(Albany NY),2015,7(3):205-218

[6] 劉 娜,李 華,張 洋,等.炎癥微環(huán)境作用下非經(jīng)典Wnt/Ca2+信號通路對牙周膜干細胞成骨分化的影響[J].中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志,2015,13(5):257-262

[7] Zhang B,Liu N,Shi H,et al.High glucose microenvironments inhibit the proliferation and migration of bone mesenchymal stem cells by activating GSK3β[J].J Bone Miner Metab,2016,34(2):140-150

[8]Liao L,Shi B,Chang H,et al.Heparin improves BMSC cell therapy:Anticoagulant treatment by heparin improves the safety and therapeutic effect of bone marrow-derived mesenchymal stem cell cytotherapy[J].Theranostics,2017,7(1):106-116

[9]Li C,Wei G,Gu Q,et al.Donor Ageand Cell Passage Affect Osteogenic Ability of Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells[J].Cell Biochem Biophys,2015,72(2):543-549

[10]Vassilev A,DePamphilis ML.Links betw een DNA Replication,Stem Cellsand Cancer[J].Genes,2017,8(2)pii:E45

[11]Debacq-Chainiaux F,Erusalimsky JD,Campisi J,et al.Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase(SA-betagal)activity,a biomarker of senescent cells in cultureand in vivo[J].Nat Protoc,2009,4:1798-1806

[12]Wang F,Pan X,Kalmbach K,et al.Robust measurement of telomere length in single cells[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2013,110:e1906-1912

[13]Revuelta M,Matheu A.Autophagy in stem cell aging[J].Aging Cell,2017,16(5):912-915

[14]Mendelsohn AR,Larrick JW.Inflammation,Stem Cells,and the Aging Hypothalamus[J].Rejuvenation Res,2017,20(4):346-349

[15]Moschouris P,Retzepi M,Petrie A,et al.Effect of Wnt3a delivery on early healing events during guided boneregeneration[J].Clin Oral Implants Res,2017,28(3):283-290

[16]Liu G,Vijayakumar S,Grumolato L,et al.Canonical Wnts function as potent regulators of osteogenesis by human mesenchymal stem cells[J].JCell Biol,2009,185(1):67-75

[17]Nemeth MJ,Mak KK,Yang Y,et al.beta-Catenin expression in the bone marrow microenvironment is required for long-term maintenance of primitive hematopoietic cells[J].Stem Cells,2009,27(5):1109-1119

[18]Marchand A,Atassi F,Gaaya A,et al.The Wnt/betacatenin pathw ay is activated during advanced arterial aging in humans[J].Aging Cell,2011,10(2):220-232