張金青，陳奮奇，汪芳珍，方強恩，師尚禮

(草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅省草業(yè)工程實驗室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

木質(zhì)素是由對-香豆醇、芥子醇和松柏醇3種木質(zhì)醇單體通過多種化學(xué)鍵連接而成的高度異質(zhì)的大分子肉桂醇脫氫聚合物[1]。這3種木質(zhì)醇分別形成對-羥基苯基木質(zhì)素(hydroxyphenyl lignin，H木質(zhì)素)、愈創(chuàng)木基木質(zhì)素(guaiacyl lignin，G木質(zhì)素)和紫丁香基木質(zhì)素(syringyl lignin，S木質(zhì)素)[2]。不同植物間及植物不同組織中木質(zhì)素的種類及其含量不同[3-4]。最新研究發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)素在植物體內(nèi)的沉積可增加植物對環(huán)境脅迫的抵抗能力[5-6]。然而，在細胞壁中木質(zhì)素卻是植物高度抗氧化的一道重要屏障，是導(dǎo)致牧草消化率降低的主要原因[6]。同時，在生物燃料生產(chǎn)過程中，木質(zhì)素是阻礙纖維素酶降解利用結(jié)構(gòu)性多糖的主要物理性障礙，嚴重影響纖維素和半纖維素的工業(yè)轉(zhuǎn)化利用[7-8]。

紫花苜蓿(Medicagosativa)由于其抗逆性強，適應(yīng)范圍廣，蛋白質(zhì)含量豐富，素有“牧草之王”之美稱[9-10]。而且，紫花苜蓿莖稈中木質(zhì)纖維素產(chǎn)量高，可用于生產(chǎn)酒精，目前被認為是最具有開發(fā)潛力的能源植物之一[11-12]。然而，莖稈中木質(zhì)素的沉積嚴重阻礙著紫花苜蓿的高效利用，Reddy等[13]研究了苜蓿莖稈中木質(zhì)素的積累對其品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素沉積量的降低，會顯著提高紫花苜蓿在反芻動物瘤胃中的消化率。Chen和Dixon[14]從生物質(zhì)型(biomass type)苜蓿品種的選育和改良角度研究指出，降低紫花苜蓿莖稈中木質(zhì)素的含量，其糖化效率(saccharification efficiency)最高可增加80%以上?？梢姡瑹o論從牧草角度還是從能源作物角度分析，木質(zhì)素均是紫花苜蓿高效利用的物理性障礙，獲得低木質(zhì)素的新型種質(zhì)是紫花苜蓿育種的重要目標。但是，關(guān)于紫花苜蓿莖稈中木質(zhì)素的發(fā)育機理至今尚未闡明，木質(zhì)素在莖稈不同組織中的分布與沉積規(guī)律仍不清楚[15]。針對上述分析，本研究以甘農(nóng)5號紫花苜蓿為材料，通過組織化學(xué)研究方法，揭示苜蓿莖稈中木質(zhì)素的分布與沉積模式，以期為低木質(zhì)素新型種質(zhì)育種研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為甘農(nóng)5號紫花苜蓿，種子由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院提供。該品種是由賀春貴教授等人選育的抗蚜新品種，具有再生速度快、高產(chǎn)、抗蚜蟲等特點，已于2010年通過國家牧草品種委員會審定為育成品種。

1.2 試驗地概況及種植管理

試驗在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)蘭州牧草試驗站進行，該地區(qū)屬溫帶半干旱大陸性氣候，四季分明、光照充足。海拔1 517.3 m，年平均降水量320 mm，年日照時數(shù)2 474.4 h，土壤pH約8.2。田間試驗小區(qū)面積3 m×3 m，3次重復(fù)。2016年4月上旬播種。播前結(jié)合整地施磷肥750 kg·hm-2、氮磷復(fù)合肥375 kg·hm-2。條播，播種行距30 cm，播量為15 kg·hm-2。播種深度1.5～2.0 cm。田間管理包括間苗、中耕除草、適時灌溉。播種當年分別于7月5日、8月25日兩次刈割，每次留茬高度均為5 cm。

1.3 試驗方法

取樣：在苜蓿初花期(2017年5月4日)，選取6株長勢一致的健康植株，每株選出最高枝條，帶回實驗室，用Gillette雙面刀片從始花節(jié)(即莖稈中第1個開花節(jié))自上而下切取每一節(jié)間，并依次升序編號，對新鮮材料立即進行徒手橫切，切片厚度為20～25 μm，所得切片用兩種不同的染色方法進行滴染，制片，置于日產(chǎn)正置萬能顯微OLYMPUS-BX61下觀測、拍照，圖片用Photoshop CS6軟件進行編號整理。

G木質(zhì)素染色(Wiesner法[16])：將切片置于載玻片上，滴加數(shù)滴2%間苯三酚乙醇溶液(95%乙醇配置)染色3 min，再滴加3 mol·L-1的鹽酸數(shù)滴，染色1 min后封片觀察，組織中G木質(zhì)素存在部位呈現(xiàn)紫紅色。

S木質(zhì)素染色(M?ule法[17-18])：將切片置于載玻片上，先用0.5%高錳酸鉀溶液滴染2 min，用蒸餾水沖洗切片數(shù)次，然后在3 mol·L-1的鹽酸溶液中滴染1 min，再用蒸餾水洗掉反應(yīng)后剩余的二氧化錳，最后用10%的氨水溶液滴染1 min，封片后觀察。組織中S木質(zhì)素存在部位呈現(xiàn)桔紅色，G木質(zhì)素存在部位呈現(xiàn)黃褐色。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫花苜蓿莖稈組織中木質(zhì)素的類型及其分布

紫花苜蓿莖稈初生維管組織(圖1A，B)和次生維管組織(圖1C，D)中木質(zhì)素的類型與分布部位如圖1所示。可以看出，苜蓿莖稈中存在G和S兩種木質(zhì)素，主要分布在木質(zhì)部、初生韌皮纖維細胞和髓射線中，但兩種木質(zhì)素的分布存在差異。圖1A顯示G木質(zhì)素的染色結(jié)果，初生木質(zhì)部導(dǎo)管分子細胞壁染色最深，其次是髓射線，初生韌皮纖維細胞染色最淺；圖1B中，髓射線與初生韌皮纖維顯色明顯，而初生木質(zhì)部導(dǎo)管顯黃褐色，沒有染上桔紅色，表明在初生木質(zhì)部導(dǎo)管分子細胞壁中只有G木質(zhì)素沉積，初生韌皮纖維細胞壁中S木質(zhì)素多于G木質(zhì)素。在莖稈次生維管結(jié)構(gòu)中，G和S木質(zhì)素在次生木質(zhì)部中大量沉積，此時，初生木質(zhì)部中仍未見S木質(zhì)素，但在鄰近初生木質(zhì)部的髓薄壁細胞壁中，出現(xiàn)了S木質(zhì)素的沉積(圖1D，箭頭)。

圖1 紫花苜蓿莖稈組織中木質(zhì)素的類型及分布Fig. 1 The type and distribution of lignin in alfalfa stem tissue

A、B為第8節(jié)間，顯示莖稈組織的初生結(jié)構(gòu)；C、D為第15節(jié)間，顯示莖稈組織的次生結(jié)構(gòu)；A、C顯示G木質(zhì)素的分布(Wiesner染色法)；B、D顯示S木質(zhì)素的分布(M?ule染色法)。pp：初生韌皮部；sx：次生木質(zhì)部；px：初生木質(zhì)部；pi：髓；pf：初生韌皮纖維；xv：初生木質(zhì)導(dǎo)管，下同。

A, B: The eighth internodes show the primary structure; C, D: The fifteenth internodes show the secondary structure; A and C show the distribution of G lignin(by Wiesner staining method); B and D show the distribution of S lignin(by M?ule staining method). Abbreviations:pp, Primary phloem; sx, Secondary xylem; px, Primary xylem; pi, Pith; pf, Primary phloem fiber; xv, Primary xylem vessel; similarly for the following figures.

2.2 木質(zhì)素的沉積模式

2.2.1G木質(zhì)素 圖2顯示初花期紫花苜蓿莖稈自上而下第1、第4、第7、第10、第13、第16節(jié)間不同發(fā)育階段維管組織中G木質(zhì)素的染色結(jié)果，可以看出，在早期初生維管束中，僅導(dǎo)管分子細胞壁中有木質(zhì)素沉積(圖2A)。隨著初生維管束的發(fā)育，初生韌皮纖維中也沉積了少量木質(zhì)素(圖2B、C)。當維管束次生結(jié)構(gòu)形成時，髓射線和次生木質(zhì)部中沉積了大量木質(zhì)素(圖2D)。隨著莖稈進一步成熟，木質(zhì)素積累越來越多，木質(zhì)化程度越來越高(圖2E、F)。

紫花苜蓿莖稈具有4個棱，從莖的橫切面看，每個棱由徑向向外膨大凸出的皮層厚角組織形成(圖2-G、H、I)。比較不同發(fā)育階段莖維管結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)莖棱厚角組織處維管束初生結(jié)構(gòu)的發(fā)育要早于兩側(cè)(圖2G、H，箭頭處)，但進入次生生長階段后，兩側(cè)維管束發(fā)育速度加快，木質(zhì)化面積不斷向髓部擴大，此時莖棱處維管束發(fā)育相對滯后。木質(zhì)素的沉積也顯示出與之相對應(yīng)的特點。

圖2 紫花苜蓿莖稈不同節(jié)位G木質(zhì)素(Wiesner染色法)的沉積Fig. 2 The deposition of G lignin in different internode of alfalfa stem(by Wiesner staining method)

A、B、C、D、E、F分別是第1、4、7、10、13、16節(jié)間，顯示維管束內(nèi)G木質(zhì)素的沉積規(guī)律；G、H和I分別是第1、7、13節(jié)間，顯示維管束間G木質(zhì)素的沉積規(guī)律。pr：髓射線，co：厚角組織。

A, B, C, D, E, and F: The 1st, 4th, 7th, 10th, 13th, and 16th internodes show the deposition pattern of G lignin within the vascular bundle; G, H and I: The lst, 7th, and 13th internodes show the deposition pattern of G lignin between the vascular bundles. Abbreviations: pr, Pith ray; co, Collenchyma

上述分析表明，G木質(zhì)素在苜蓿莖稈組織中的沉積遵循以下規(guī)律：在維管束內(nèi)，木質(zhì)素以“初生木質(zhì)部導(dǎo)管→初生韌皮纖維→次生木質(zhì)部和髓射線”的模式沉積。在維管束之間，木質(zhì)素最先在厚角組織處維管束初生結(jié)構(gòu)中沉積，隨之再向兩側(cè)維管束延伸；在次生生長階段，兩側(cè)維管束中木質(zhì)素沉積速度加快，沉積面積不斷向髓中心擴大。

2.2.2S木質(zhì)素 S木質(zhì)素在維管束內(nèi)的沉積模式與G木質(zhì)素相似，也是隨節(jié)間下移木質(zhì)素沉積增多，木質(zhì)化程度升高(圖3)。在初生維管束早期沒有S木質(zhì)素的沉積(圖3A)。隨著初生維管束的發(fā)育，初生韌皮纖維細胞壁中開始有少量S木質(zhì)素的積累(圖3B)。當次生維管束逐步發(fā)育形成時，S木質(zhì)素在次生木質(zhì)部和髓射線中大量出現(xiàn)(圖3C、D、E)。在莖稈組織進一步成熟后，髓薄壁細胞壁中也出現(xiàn)了大量的S木質(zhì)素(圖3F)。

圖3 紫花苜蓿莖稈不同節(jié)位S木質(zhì)素(M?ule染色法)的沉積Fig. 3 The deposition of S lignin in different internode of alfalfa stem(by M?ule staining method)

A、B、C、D、E、F分別是第1、4、7、10、13、16節(jié)間，顯示維管束內(nèi)S木質(zhì)素的沉積規(guī)律；圖G、H、I分別是第4、10、16節(jié)間，顯示維管束間S木質(zhì)素的沉積規(guī)律。

A, B, C, D, E, and F: The 1st, 4th, 5th, 10th, 13th, and 16th internodes show the deposition pattern of S lignin within the vascular bundle; G, H and I: The 4th, 10th, and 16th internodes show the deposition pattern of S lignin between the vascular bundles.

S木質(zhì)素在維管束之間的沉積規(guī)律與G木質(zhì)素相同，即在維管束初生結(jié)構(gòu)中，S木質(zhì)素首先在厚角組織處的初生韌皮纖維中沉積，然后在兩側(cè)積累(圖3G，箭頭)。隨著維管束次生結(jié)構(gòu)的發(fā)育，兩側(cè)維管束中的木質(zhì)化速度加快，而厚角組織處維管束的木質(zhì)化速度相對較慢(圖3I)。

上述分析表明，在維管束內(nèi)，S木質(zhì)素以“初生韌皮纖維→次生木質(zhì)部和髓射線→髓薄壁細胞”的模式沉積。在維管束之間，S木質(zhì)素以“厚角組織處維管束→厚角組織間維管束”的模式沉積。

對比觀察圖2、圖3可以發(fā)現(xiàn)，雖然兩種木質(zhì)素單體的沉積模式相似，但S木質(zhì)素的沉積遲于G木質(zhì)素；初生木質(zhì)部導(dǎo)管中未發(fā)現(xiàn)S木質(zhì)素，在次生生長階段，髓薄壁細胞壁中出現(xiàn)了S木質(zhì)素的沉積。

3 討論

3.1 苜蓿莖稈中木質(zhì)素種類、分布與沉積模式的植物學(xué)意義

木質(zhì)素作為細胞壁次生壁的三大主要成分之一，在維管植物結(jié)構(gòu)的堅硬化、水肥運輸和抗病性方面具有重要作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿莖稈初生木質(zhì)部導(dǎo)管中只有G木質(zhì)素沉積，而初生韌皮纖維細胞中S木質(zhì)素占優(yōu)勢(圖1A、B)。Menden等[20]研究指出植物在受到病原物侵染時會選擇性增加S木質(zhì)素單體的含量。木質(zhì)素具有疏水性，導(dǎo)管是木質(zhì)部中最主要的輸導(dǎo)組織[21]，因此木質(zhì)部中G木質(zhì)素的沉積可增強其對水分的輸導(dǎo)能力[16]。由此分析，苜蓿莖稈初生韌皮纖維中S木質(zhì)素的大量沉積可能與抗病有關(guān)，G木質(zhì)素的沉積主要與組織結(jié)構(gòu)堅硬化和水肥運輸有關(guān)。

G木質(zhì)素單體易于和其他基團結(jié)合形成穩(wěn)定的化合物而較S木質(zhì)素單體更難降解[22]。因此普遍認為，通過降低牧草中G/S的比例可以改善牧草的品質(zhì)，提高牧草的消化率[23]，但是這一觀點目前仍存在爭議[22]。Reddy等[13]研究指出，降低木質(zhì)素的含量可以提高反芻動物對苜蓿的消化率，但苜蓿中G/S比值的改變并沒有對消化率產(chǎn)生明顯影響。G、S木質(zhì)素對消化率的影響機理目前尚不清楚，因此，為了提高牧草消化率，簡單降低G/S值可能并不合理。另外，從生物燃料生產(chǎn)角度講，現(xiàn)有研究結(jié)果表明，降低紫花苜蓿中S木質(zhì)素單體的含量，可顯著增加生物酒精的產(chǎn)量[23]。在楊屬(Populus)植物中，G/S值的升高與酒精和糖產(chǎn)量均呈正相關(guān)[24-25]。但是，就目前研究結(jié)果看，木質(zhì)素含量及其組成與生物質(zhì)能的轉(zhuǎn)化效率的關(guān)系仍然存在較大爭議[12]。在苜蓿中，S木質(zhì)素含量降低可增加酒精產(chǎn)量，但G/S值的改變對糖化效率的影響并不明顯[14]。Pedersen等[26]研究指出，降低高粱(Sorghumbicolor)、柳枝稷(Panicumvirgatum)、紫花苜蓿等能源作物木質(zhì)素的含量，并不能顯著提高生物燃料產(chǎn)率。Fu等[3]研究了柳枝稷中木質(zhì)素組成與生物質(zhì)能的轉(zhuǎn)化關(guān)系，結(jié)果表明，隨著G/S值的升高，酒精產(chǎn)量顯著增加，但Sarath等[27]的研究卻取得了截然相反的結(jié)果，認為G/S值的改變與酒精產(chǎn)量無關(guān)。木質(zhì)素的分布與沉積隨植物種類及其組織部位不同而存在差異[28]。本研究結(jié)果也表明，苜蓿莖稈中兩種木質(zhì)素的沉積量與發(fā)育階段和分布部位相關(guān)?？梢?，植物中木質(zhì)素的發(fā)生發(fā)育過程與生物功能復(fù)雜多變，要完全揭示木質(zhì)素的作用機能，還需要從分子水平進一步深入研究。

Vanholme等[29]從生物適應(yīng)性進化角度分析，認為木質(zhì)素的沉積是植物對于陸生生活環(huán)境的適應(yīng)，主要為植物的直立生長提供支撐作用。本研究結(jié)果顯示，苜蓿同一節(jié)位莖稈組織中維管束之間木質(zhì)素的發(fā)生與沉積并不同步，在莖維管束初生生長時期莖棱厚角組織處維管束內(nèi)木質(zhì)素的沉積早于其兩側(cè)維管束(圖2G、H，3G)。目前普遍認為，紫花苜蓿起源于“近東中心”——小亞細亞、外高加素、伊朗和土庫曼的高地，這些地區(qū)的特點是春季遲臨，夏季短促[30]，木質(zhì)素在維管束中這種獨特的發(fā)生特性可能有利于其返青期再生枝的快速直立生長，這可能也是苜蓿對北溫帶大陸性氣候短暫生長季的一種適應(yīng)對策。

3.2 木質(zhì)素沉積的異質(zhì)性

木質(zhì)素沉積的異質(zhì)性是指隨著植物種類、個體、器官組織、細胞類型以及環(huán)境條件的不同，其組成、含量和結(jié)構(gòu)也不完全相同，甚至變化很大，這是木質(zhì)素生物合成過程中不同類型酶時空表達的結(jié)果[31-33]。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)木質(zhì)素沉積突變體中，木質(zhì)素異位沉積于髓薄壁細胞中，這種異位沉積在幼莖和成熟莖中都存在[5]，但本研究發(fā)現(xiàn)，在紫花苜蓿幼莖初生木質(zhì)部中只有G木質(zhì)素沉積，而在成熟莖稈髓薄壁細胞中存在S木質(zhì)素，這與Saito等[34]在雞爪槭(Acermicranthum)中的研究結(jié)果一致。截至目前，只能得到木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)模型，仍未能獲得完整的天然木質(zhì)素單體[35]，紫花苜蓿莖稈中木質(zhì)素的異質(zhì)性沉積也許能為天然木質(zhì)素單體提取提供一條可行的途徑。

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