符 杰，胡延春，陳偉紅，翁嘉華，胡力文，石 真，何亞軍，莫 全，王 婭，任志華，彭廣能，左之才，鄧俊良

(動物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，環(huán)境公害與動物疾病四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，四川 溫江 611130)

紫莖澤蘭(Eupatoriumadenophorum)又名解放草、破壞草[1]等，是菊科澤蘭屬多年生草本植物。紫莖澤蘭因其具有強(qiáng)大的生態(tài)適應(yīng)性和入侵性，可通過釋放化感物質(zhì)影響土壤微環(huán)境，從而抑制其他植物的生長，甚至導(dǎo)致本土物種的消失[2]。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，紫莖澤蘭現(xiàn)已是我國排在首位的外來入侵物種，且在四川、重慶、廣西、貴州等地危害最為嚴(yán)重[3]。紫莖澤蘭作為世界性毒草，不僅侵占草地，造成山林退化，而且給畜牧業(yè)特別是草地畜牧業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重?fù)p失[4]。在飼草匱乏的季節(jié)，日常的放牧或者喂食中，如果家畜誤食紫莖澤蘭或者含有紫莖澤蘭的飼料，會導(dǎo)致牛、羊等其他家畜接觸性皮炎[5]，有的患畜會出現(xiàn)精神消沉、腹瀉、脫毛、消瘦、肌肉發(fā)生震顫或者強(qiáng)直性痙攣[6]、肝臟損傷[7-10]等相應(yīng)的中毒癥狀及病理變化。而且，紫莖澤蘭的花粉和種子還能誘發(fā)馬屬動物過敏性支氣管炎[11]。因此，紫莖澤蘭不僅會造成當(dāng)?shù)刂参餅?zāi)難性的破壞，同時也給畜牧業(yè)帶來較為嚴(yán)重的損失。

國內(nèi)外對紫莖澤蘭引起反芻動物中毒的毒性作用還未進(jìn)行系統(tǒng)研究，對薩能奶山羊(Saanen goat)血常規(guī)及主要實(shí)質(zhì)器官的病理學(xué)影響研究也未見詳細(xì)報(bào)道。本研究探討紫莖澤蘭對薩能奶山羊血常規(guī)及肝、脾、腎等臟器病理學(xué)的影響，旨為進(jìn)一步研究反芻動物紫莖澤蘭中毒機(jī)理及紫莖澤蘭防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇體重相近、體格健康、5～6月齡的薩能奶山羊16只、公母各半，隨機(jī)分成公母各半的對照組及試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組，每組4只；有研究表明，脫毒的紫莖澤蘭可作為飼料代替小麥麩[12]，且根據(jù)韓龍等[13]與周自瑋等[14]的研究結(jié)果，將山羊日糧與添加料設(shè)為20%∶80%(表1)，對照組動物采食基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組動物每天分別飼喂添加自然風(fēng)干后用粉碎機(jī)粉碎，未脫毒的紫莖澤蘭粉(采自四川省涼山州西昌市黃聯(lián)關(guān)鎮(zhèn))的日糧。試驗(yàn)于2014年4月12日至2014年7月29日在四川省成都市溫江區(qū)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)進(jìn)行。試驗(yàn)預(yù)試期2周，正試期12周。

1.2 飼養(yǎng)管理

16只試驗(yàn)?zāi)躺窖蜻M(jìn)行常規(guī)免疫及驅(qū)蟲后集中飼養(yǎng)于已消毒的養(yǎng)殖場地，統(tǒng)一飼養(yǎng)管理。每天分別在09:00和17:00各飼喂一次，飼喂期間不限采食和飲水。每只每次投喂0.5 kg試驗(yàn)飼料，共計(jì)1 kg·d-1，定量飼喂。每天對羊圈進(jìn)行清掃，保持其干燥清潔。按照薩能奶山羊地方飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)選購山羊日糧飼料(日糧飼料原料為風(fēng)干狀態(tài))，試驗(yàn)日糧組成及營養(yǎng)水平如表2所列。

表1 試驗(yàn)飼料配比Table 1 Ratios of experimental feed

表2 試驗(yàn)日糧組成及營養(yǎng)水平Table 2 Composition and nutrient levels of the experimental diet

1.3 血液生理指標(biāo)的測定

試驗(yàn)期每隔14 d，于晨后對每組薩能奶山羊進(jìn)行空腹頸靜脈采血2 mL，用真空(肝素鈉)抗凝管進(jìn)行抗凝，分別采用試管稀釋法，sahli比色法以及硝基四唑氮藍(lán)(NBT)還原法測定血液中的白細(xì)胞(WBC)、血紅蛋白(HGB)及中性粒細(xì)胞(NEUT)含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)過Excel初步處理后，利用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件One-way ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著時采用Duncan法進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)結(jié)果以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)并標(biāo)以顯著水平表示。

1.5 組織病理學(xué)觀察

將全部薩能奶山羊進(jìn)行頸靜脈放血處死，進(jìn)行解剖檢查，觀察組織器官有無明顯的病理變化。將采集的對照組與試驗(yàn)組奶山羊的肝、脾、腎經(jīng)4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，甲苯透明，石蠟包埋，5 μm切片，HE常規(guī)染色后，于光鏡下觀察并記錄其組織學(xué)變化。最后,將飼喂不同紫莖澤蘭比例的試驗(yàn)組和對照組進(jìn)行觀察比較，并記錄觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 對薩能奶山羊血常規(guī)的影響

2.1.1白細(xì)胞(WBC)變化 試驗(yàn)Ⅰ組在試驗(yàn)56與84 d時白細(xì)胞數(shù)極顯著高于對照組(P<0.01)，于70 d時顯著高于對照組(P<0.05)(表3)。試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組血液中白細(xì)胞數(shù)目均在試驗(yàn)42 d顯時著高于對照組(P<0.05)，且從試驗(yàn)56 d開始到84 d，試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組極顯著高于對照組(P<0.01)。

2.1.2淋巴細(xì)胞(LY)變化 試驗(yàn)Ⅰ組56 d至70 d顯著低于對照組(P<0.05)，且在試驗(yàn)84 d時極顯著低于對照組(P<0.01)(表4)。試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組血液中LY數(shù)目均于試驗(yàn)42 d時顯著低于對照組(P<0.05)，當(dāng)試驗(yàn)從56 d進(jìn)行到84 d，試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組表現(xiàn)為極顯著低于對照組(P<0.05)。

表3 各組薩能奶山羊血液中白細(xì)胞(WBC)的變化Table 3 Changes in white blood cell count for each group

同行中的*和**分別表示試驗(yàn)組與對照組差異顯著(P<0.05 )和極顯著(P<0.01 )。表4、表5和表6同。

* and ** within the same row indicate significant difference between control group and treatment group at 0.01 and 0.05 level, respectively; this applies to Table 4, Table 5, and Table 6.

表4 各組薩能奶山羊血液中淋巴細(xì)胞(LY)的變化Table 4 Changes in LY for each group

2.1.3中性粒細(xì)胞(NEUT)變化 整個試驗(yàn)階段，試驗(yàn)Ⅰ組在試驗(yàn)56 d時顯著高于對照組(P<0.05)(表5)。在試驗(yàn)84 d時，試驗(yàn)Ⅰ組NEUT數(shù)目極顯著高于對照組(P<0.01)。試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組血液中NEUT數(shù)目均在試驗(yàn)42 d時顯著高于對照組(P<0.05)，分別于試驗(yàn)70 d、56 d至試驗(yàn)結(jié)束NEUT數(shù)目極顯著高于對照組(P<0.01)。

2.1.4血紅蛋白(HGB)含量變化 試驗(yàn)Ⅰ組在試驗(yàn)56 d到70 d顯著低于對照組(P<0.05)，在試驗(yàn)84 d時極顯著低于對照組(P<0.01)(表6)。與對照組相比，試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組在試驗(yàn)28 d時均顯著低于對照組(P<0.05)，而且均從試驗(yàn)42 d到84 d極顯著低于對照組(P<0.01)。

2.2 對主要臟器的病理學(xué)影響

2.2.1肝臟 各試驗(yàn)組山羊肝臟隨紫莖澤蘭飼喂劑量增加而色澤變淡，表面有褐色斑點(diǎn)，并未見明顯出血點(diǎn)。在試驗(yàn)組Ⅰ中，肝細(xì)胞明顯腫脹，部分肝細(xì)胞溶解、壞死，肝索排列紊亂，肝竇狹窄甚至閉鎖，部分肝竇淤血。試驗(yàn)組Ⅱ中，肝細(xì)胞主要為水泡變性。試驗(yàn)組Ⅲ中，肝細(xì)胞脂肪變性，部分發(fā)生凝固性壞死，并伴有中性粒細(xì)胞浸潤(圖1)。由此可見，隨著試驗(yàn)時間延長，各試驗(yàn)組肝臟病變越發(fā)嚴(yán)重。

表5 各組薩能奶山羊血液中性粒細(xì)胞(NEUT)的變化Table 5 Changes in NEUT for each group

表6 紫莖澤蘭對奶山羊血紅蛋白(HGB)的影響Table 6 Effect of Eupatorium adenophorum on HGB in Saanen goat

圖1 各組薩能奶山羊肝臟病理變化Fig. 1 Histopathological changes in the liver for each group of Saanen goats

A：對照組肝細(xì)胞，×400，HE；B：①肝細(xì)胞腫脹明顯，②肝細(xì)胞溶解、壞死，肝索排列紊亂，③肝竇狹窄閉鎖，肝竇淤血，×400，HE；C：肝細(xì)胞水泡變性，×400，HE；D：④肝細(xì)胞凝固性壞死，⑤脂肪變性，⑥中性粒細(xì)胞浸潤，×400，HE。

A：Liver cells of control, ×400, HE; B: ①Some hepatic cells are tumid, ②dissolved and necrotic, ③the hepatic cords is narrow, blocked and congested in Trial Ⅰ, ×400, HE; C: Vacuolar degeneration of liver cells in Trial Ⅱ, ×400, HE; D: ④Coagulation necrosis, ⑤steatosis and ⑥neutrophil infiltration of liver cells in Trial Ⅲ, ×400, HE.

2.2.2脾臟 與對照組相比，各試驗(yàn)組有脾臟輕度腫大，被膜增厚，色澤變淡的現(xiàn)象。各試驗(yàn)組均出現(xiàn)脾組織嚴(yán)重充血，紅髓區(qū)充血。試驗(yàn)組Ⅰ還伴有淋巴細(xì)胞減少的現(xiàn)象。試驗(yàn)組Ⅱ紅髓區(qū)且噬細(xì)胞數(shù)量增多，試驗(yàn)組Ⅲ則出現(xiàn)含鐵血黃素增多(圖2)。由此可見，隨著試驗(yàn)時間延長，各試驗(yàn)組脾臟病變越發(fā)嚴(yán)重。

2.2.3腎臟 各試驗(yàn)組腎臟均出現(xiàn)不同程度腫大，質(zhì)地變?nèi)?，被膜緊張。組織切片可觀察到試驗(yàn)組Ⅰ中腎小管發(fā)生充血，腎小管上皮細(xì)胞腫脹。試驗(yàn)組Ⅱ中間質(zhì)小靜脈和毛細(xì)血管擴(kuò)張淤血，腎組織伴有顆粒變性和水泡變性的現(xiàn)象。試驗(yàn)組Ⅲ中腎小球細(xì)胞淤血，間質(zhì)淤血，部分腎小管上皮細(xì)胞壞死(圖3)。

圖2 各組薩能奶山羊脾臟病理變化Fig. 2 Histopathological changes in the spleen for each group of Saanen goats

A：對照組為正常脾組織×400，HE；B：試驗(yàn)組Ⅰ中①紅髓區(qū)充血，②淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，×400，HE ；C：試驗(yàn)組Ⅱ中③脾組織嚴(yán)重出血，④紅髓區(qū)巨噬細(xì)胞數(shù)量增多，×400，HE；D：試驗(yàn)組Ⅲ中⑤紅髓區(qū)充血，⑥含鐵血黃素增多，×400，HE。

A: Spleen of control ×400, HE; B: ①Congestion of the red pulp, ②lymphocytes decreased in TrialⅠ， ×400, HE; C: ③The splenic tissue was bleeding and ④macrophages increased in the red pulp in TrialⅡ， ×400, HE; D: ⑤Congestion of the red pulp, ⑥hemosiderin increased in spleen in Trial Ⅲ×400, HE.

圖3 各組薩能奶山羊腎臟病理變化Fig. 3 Histopathological changes in the kidney for each group of Saanen goats

A：對照組腎組織，×400，HE；B：①腎小管充血，②腎小管上皮細(xì)胞腫脹，×400，HE；C：③間質(zhì)小靜脈，④毛細(xì)血管淤血，⑤腎小管上皮細(xì)胞水泡變性，×400，HE；D：⑥腎小球細(xì)胞淤血，⑦間質(zhì)淤血，⑧腎小管上皮細(xì)胞壞死，×400，HE。

A:Kidney of control, ×400, HE; B: ①The renal tubules were congested and ②the renal tubular epithelial cells swelled, ×400, HE; C: ③Stromal venules and ④capillaries congestion, ⑤vacuolar degeneration of renal tubular epithelial cells, ×400, HE; D: ⑥Glomerular cell and ⑦stromal congestion, ⑧necrosis of renal tubular epithelial cells, ×400, HE.

3 討論與結(jié)論

四川涼山彝族自治州是紫莖澤蘭重災(zāi)區(qū)之一，紫莖澤蘭的瘋狂傳播生長致使涼山的絕大部分山林田地以及牧場被侵占，牲畜被迫采食而中毒的事件也屢屢發(fā)生，給牧民造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。研究表明，紫莖澤蘭全草所含有的有毒成分主要包括9-羰基-10,11-去氫澤蘭酮(Euptox A)、佩蘭毒素、香豆精、鞣質(zhì)，還有生物堿類等[15]，其中分離到的Euptox A對牲畜有劇毒，它是導(dǎo)致肝損傷的主要毒素[16-19],也會造成動物的其他器官和組織的毒性損傷，嚴(yán)重時甚至導(dǎo)致動物死亡。

本研究通過給予對照組奶山羊飼喂全價(jià)飼料，試驗(yàn)組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別飼喂40%(0.4 kg·d-1)、60%(0.6 kg·d-1)、80%(0.8 kg·d-1)劑量紫莖澤蘭日糧，結(jié)果表明，各試驗(yàn)組的LY值于試驗(yàn)后期均極顯著低于對照組(P<0.01)，NEUT顯著升高(P<0.05)，后期極顯著高于對照組(P<0.01)。這說明不同劑量的紫莖澤蘭均可能對薩能奶山羊機(jī)體免疫系統(tǒng)造成影響。試驗(yàn)動物采食紫莖澤蘭中毒后，其機(jī)體免疫能力下降，導(dǎo)致機(jī)體易受致病菌等的入侵而引發(fā)各種炎癥反應(yīng)。通過比較各試驗(yàn)組值可以看出，紫莖澤蘭能顯著引起薩能奶山羊WBC值升高，而且存在明顯時間和劑量效應(yīng)，紫莖澤蘭添加量越高、飼喂時間越長，白細(xì)胞值越高，試驗(yàn)組Ⅲ最為明顯，說明當(dāng)長期采食紫莖澤蘭可引起薩能奶山羊機(jī)體持續(xù)性炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致白細(xì)胞水平升高。這與周自瑋等[14]的研究結(jié)論一致。整個試驗(yàn)階段，隨著紫莖澤蘭劑量的增加，HGB水平表現(xiàn)為下降越明顯，說明紫莖澤蘭對機(jī)體的造血功能產(chǎn)生較顯著影響，這與李厚勇等[20]研究結(jié)論一致。

另一方面，本研究通過對紫莖澤蘭中毒的薩能奶山羊組織切片進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)紫莖澤蘭對試驗(yàn)組薩能奶山羊主要實(shí)質(zhì)性器官肝、脾、腎臟的組織結(jié)構(gòu)具有損害作用，可導(dǎo)致各器官的功能性細(xì)胞變性與壞死，這就表明紫莖澤蘭對反芻動物——薩能奶山羊具有毒性作用，可對奶山羊造成肝腎毒性，影響其機(jī)體正常的新陳代謝功能，從而導(dǎo)致奶山羊的生長異常。董強(qiáng)等[21]也報(bào)道了用紫莖澤蘭全草飼喂小鼠后會造成小鼠生長緩慢，肝、腎等也呈現(xiàn)不同程度的病理損害。紫莖澤蘭雖然是良好的飼料來源，但未脫毒的紫莖澤蘭不適宜作為食草動物的飼料[22]。

綜上，本研究通過向薩能奶山羊日糧中添加不同劑量的紫莖澤蘭粉，結(jié)果導(dǎo)致了試驗(yàn)組奶山羊肝、脾、腎器官出現(xiàn)不同程度的病理損傷，而試驗(yàn)組奶山羊血液指標(biāo)的改變也表明了采食紫莖澤蘭會造成試驗(yàn)動物中毒，這為進(jìn)一步完善紫莖澤蘭引起山羊中毒的毒理學(xué)研究以及紫莖澤蘭的開發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)。

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