占今舜，詹 康，陳小連，霍俊宏，趙國琦

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，江西 南昌 330200； 2.揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚州 225009)

苜蓿素(Tricin)為4′，5，7-三羥基- 3′，5′-二甲氧基黃酮，是一種黃酮類化合物。苜蓿素是在感染銹病的小麥(Triticumaestivum)葉5片中首次發(fā)現(xiàn)的，之后在苜蓿(Medicagosativa)等牧草和水稻(Oryzasativa)、高粱(Sorghumbicolor)和大麥(Hordeumvulgare)等谷物植物中發(fā)現(xiàn)[1]。據(jù)報道，苜蓿素能夠幫助植物抵御細菌和真菌的侵襲，并抑制野草生長，因此，可以將其開發(fā)為一種除草劑[2]。Bichoff等[3]研究發(fā)現(xiàn)，從苜蓿中提取的苜蓿素能夠使腸道組織平滑肌松弛，具有輕微的雌激素活性和發(fā)揮抗氧化作用。Verschoyle等[4]研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿素有抗小鼠胃腸道癌變的作用，被認為可以開發(fā)成一種臨床抗癌癥的藥物。另外，苜蓿素還有抗病毒、抗結(jié)核和免疫調(diào)節(jié)活性等作用[5-7]。我國燕麥(Avenasativa)、苜蓿等植物的種植規(guī)模逐漸擴大[8-9]，提取苜蓿素的原料來源逐漸豐富。

乳腺上皮細胞是合成和分泌乳汁的主要場所，當(dāng)其被金黃葡萄球菌、大腸桿菌和鏈球菌等細菌感染后，會產(chǎn)生乳房炎，進而導(dǎo)致產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)下降。而脂多糖(LPS)是大腸桿菌等革蘭氏陰性菌細胞壁中的一種成分，進入體內(nèi)引起組織發(fā)生炎癥反應(yīng)，因此可導(dǎo)致乳腺組織損傷[10]。研究發(fā)現(xiàn)，在 LPS刺激下，奶牛乳腺上皮細胞中炎癥因子(TNF-α和IL-1β)的表達上調(diào)，抗氧化酶活性降低，丙二醛(MDA)含量升高，細胞膜滲透性升高，促使細胞凋亡加快[11-13]。另外，LPS能夠下調(diào)乳腺上皮細胞脂肪酸攝取、活化與轉(zhuǎn)運等相關(guān)基因表達，從而抑制乳脂合成，能夠通過影響mTOR 和JAK2-STAT5 等細胞內(nèi)信號途徑抑制乳蛋白的合成[14-15]。以上研究結(jié)果說明，LPS能夠?qū)е履膛Ｈ橄偕掀ぜ毎軗p，對乳成分的合成具有一定的影響。苜蓿素具有抗氧化和免疫應(yīng)激等作用，而LPS能夠引起奶牛乳腺上皮細胞產(chǎn)生炎癥和影響乳品質(zhì)，因此，本研究分析苜蓿素對脂多糖刺激下體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細胞炎癥因子和乳蛋白合成相關(guān)基因表達的影響，以期了解苜蓿素是否能夠通過發(fā)揮抗炎癥作用來改善乳蛋白的合成。

1 材料與方法

1.1 材料

苜蓿素(≥98%，色譜純)，從燕麥中提取，購于上海源葉生物科技有限公司；脂多糖(LPS，血清型O55:B5)購于美國Sigma公司；試驗所用奶牛乳腺上皮細胞與占今舜等[16]相同。

1.2 試驗方法

1.2.1細胞活性檢測 試驗于2016年9月開始進行，試驗分為4組，即基礎(chǔ)培養(yǎng)基(對照組)、基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入1 μg·mL-1的LPS(L)、基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入1 μg·mL-1的LPS和10 μg·mL-1苜蓿素(L+T)和基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10 μg·mL-1苜蓿素(T)，每組5個重復(fù)，其中苜蓿素用二甲基亞砜(DMSO)(索萊寶，北京)完全溶解，4個處理組中的DMSO含量低于2‰。細胞活性采用CCK-8法進行檢測，試驗方法參照Matsui等[17]。

1.2.2抗氧化指標(biāo)的測定 取密度為5×105個·mL-1細胞接種到六孔板，方法同上。一氧化氮(NO)、乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)等指標(biāo)的測定方法參照占今舜等[16]。

1.2.3細胞總RNA的提取和RT-PCR條件 取密度為5×105mL-1細胞接種到6孔板，方法同上。試驗結(jié)束時，進行RNA提取和cDNA的合成。提取和合成方法參照占今舜等[18]。RT-PCR試劑盒由Roche公司提供，PCR反應(yīng)液配制在冰上進行，反應(yīng)液包括Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，PCR級水3 μL，cDNA 5 μL。將配制的反應(yīng)液加入96孔反應(yīng)板(Roche公司提供)中，在Light Cycler?96 PCR儀(Roche公司)上進行PCR檢測。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性600 s；PCR反應(yīng)為95 ℃、10 s，退火60 ℃和72 ℃延伸各10 s，循環(huán)45次；融解曲線分析65 ℃、60 s。

1.2.4引物設(shè)計 根據(jù)Gene Bank中的基因序列，引物設(shè)計采用Primer 5.0軟件完成，引物合成則由Invitrogen公司完成。引物序列如表1和2所列。

表1 炎癥因子相關(guān)基因的引物序列Table 1 Primer sequences for inflammatory genes

表2 乳蛋白合成相關(guān)基因的引物序列Table 2 Primer sequences for lacto-protein genes

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)先用Excle 2007進行預(yù)處理，基因表達量采用2-ΔΔCt方法進行計算。數(shù)據(jù)采用(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)表示，并在IBM SPSS Statistics 21.0軟件上進行ANOVA分析，LSD法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿素對乳腺上皮細胞活性的影響

結(jié)果表明，苜蓿素具有促進細胞增殖的作用。只加入苜蓿素的T組的奶牛乳腺上皮細胞相對活性顯著高于其他各組(P<0.01)；奶牛乳腺上皮細胞活性在脂多糖(L)刺激下顯著降低(P<0.05)，而添加苜蓿素(L+T)較脂多糖處理能夠顯著提高細胞活性(P<0.05)(圖1)。

2.2 苜蓿素對乳腺上皮細胞抗氧化性能的影響

在LPS刺激下，乳腺上皮細胞LDH活性和NO、MDA含量極顯著升高(P<0.01)，SOD活性極顯著降低(P<0.01)；而添加苜蓿素后，NO和MDA含量較L處理顯著降低(P<0.01)，SOD活性顯著升高(P<0.01)(表3)。

2.3 苜蓿素對乳腺上皮細胞炎癥因子相關(guān)基因的影響

與對照組相比，添加苜蓿素能夠極顯著升高細胞MyD88的表達(P<0.01)(表4)。在LPS刺激下，細胞IL-1β、IL-6、TNF-α、TLR2、TLR4和MyD88的表達均顯著升高(P<0.01)，而較LPS處理添加苜蓿素能夠顯著降低IL-1β、TNF-α、TLR2和TLR4的表達(P<0.01)。以上結(jié)果表明，苜蓿素能夠抑制LPS誘導(dǎo)下細胞炎癥因子的產(chǎn)生。

圖1 苜蓿素對脂多糖刺激下奶牛乳腺上皮細胞活性的影響 Fig. 1 Effect of tricin on viability of LPS-induced BMECs

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。Control，對照，表示基礎(chǔ)培養(yǎng)基，L表示基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入1 μg·mL-1LPS，L+T表示基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入1 μg·mL-1LPS+10 μg·mL-1苜蓿素，T表示基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10 μg·mL-1苜蓿素，下同。

Different lowercase and capital letters indicate significant difference at 0.05 and 0.01 level, respectively, and the same letter indicate no significant difference at the 0.05 level. Control, basic medium; L, basic medium with 1 μg·mL-1LPS; L+T, basic medium with 1 μg·mL-1LPS+10 μg·mL-1tricin; T, basic medium with 10 μg·mL-1tricin; similarly for the following tables.

表3 苜蓿素對脂多糖刺激下乳腺上皮細胞抗氧化指標(biāo)的影響Table 3 Effect of tricin on antioxidant indices of mammary epithelial cells treated with LPS

同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。Control,對照,表示基礎(chǔ)培養(yǎng)基，L表示基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入1 μg·mL-1LPS，L+T表示基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入1 μg·mL-1LPS+10 μg·mL-1苜蓿素，T表示基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10 μg·mL-1苜蓿素。表4、表5同。

Different lowercase and capital letters indicate significant difference at 0.05 and 0.01 level, respectively, and the same letter indicate no significant difference at the 0.05 level. Control, basic medium; L, basic medium with 1 μg·mL-1LPS; L+T, basic medium with 1 μg·mL-1LPS+10 μg·mL-1tricin; T, basic medium with 10 μg·mL-1tricin; this also applies to Table 4 and Table 5.

2.4 苜蓿素對乳腺上皮細胞內(nèi)信號通路及乳成分合成相關(guān)基因表達的影響

無LPS刺激下，添加苜蓿素能夠極顯著提高細胞JAK2、STAT5、mTOR、4EBP1和S6K1的表達量(P<0.01)，但降低了CAT1的表達(P<0.01),LAT1無明顯變化(表5)。在LPS刺激下，細胞CAT1、LAT1、STAT5、mTOR和4EBP1的表達顯著降低(P<0.01或P<0.05)，而添加苜蓿素能夠顯著升高STAT5的表達(P<0.01)和降低CAT1的表達(P<0.01)。結(jié)果說明，添加苜蓿素能夠促進乳蛋白的合成；LPS刺激下，乳蛋白合成受阻，而添加苜蓿素對乳蛋白合成影響不明顯。

表4 苜蓿素對脂多糖刺激下乳腺上皮細胞炎癥因子基因表達的影響Table 4 Effect of tricin on inflammatory gene expression of mammary epithelial cells treated with LPS

表5 苜蓿素對脂多糖刺激下乳腺上皮細胞內(nèi)信號通路及乳蛋白合成相關(guān)基因表達的影響Table 5 Effect of tricin on signal path and lactoprotein synthesis of mammary epithelial cells treated with LPS

3 討論

3.1 苜蓿素對奶牛乳腺上皮細胞抗炎的影響

一般情況下，體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡。體內(nèi)產(chǎn)生的自由基過多，會導(dǎo)致細胞中的不飽和脂肪酸產(chǎn)生MDA，進而致使細胞解體，促使細胞死亡[19]。Shi等[12]研究發(fā)現(xiàn)，LPS能夠?qū)е履膛Ｈ橄偕掀ぜ毎腉SH-Px、SOD和CAT活性降低，而MDA含量升高。劉立新等[20]和王亨等[21]研究發(fā)現(xiàn)，LPS能夠抑制奶牛乳腺上皮細胞的增殖。而本研究也發(fā)現(xiàn)，LPS降低細胞的成活率和抗氧化能力。以上結(jié)果說明，脂多糖可能會增加細胞內(nèi)自由基，導(dǎo)致細胞損傷，進而抑制細胞增殖。通過體外細胞培養(yǎng)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，添加適量的苜蓿黃酮、大豆黃酮和染料木黃酮能夠提高奶牛乳腺上皮細胞的活性和SOD活性，降低MDA的含量[22-23]。說明黃酮類物質(zhì)可以通過提高細胞的抗氧化能力，促進細胞的增殖。從本研究結(jié)果看，苜蓿素能夠發(fā)揮抗氧作用，抑制LPS誘導(dǎo)下細胞的增殖。

LDH是糖酵解過程中的一種氧化還原類酶，能夠催化丙酮酸與乳酸之間的可逆反應(yīng)。只有當(dāng)細胞受到損傷時，LDH活性會升高。研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿黃酮能夠降低熱應(yīng)激下奶牛乳腺上皮細胞的LDH的活性[16]；二羥異黃酮和三羥異黃酮能夠降低過氧化氫誘導(dǎo)的中國倉鼠卵巢細胞的 LDH釋放量[24]。結(jié)果說明，黃酮類化合物能夠降低LDH的活性。本研究結(jié)果與上述研究相似，說明LPS能夠造成細胞損傷，導(dǎo)致細胞LDH活性升高，而添加苜蓿素能夠降低LDH活性，進而保護細胞免受損傷。LPS是一種重要的炎癥反應(yīng)因子，能夠誘導(dǎo)TNF-ɑ、IL-1β、IL-6等細胞因子參與炎癥反應(yīng)。NO是細胞內(nèi)和細胞間的重要信號分子，具有調(diào)節(jié)上皮細胞正常功能等作用，且在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)細胞和組織發(fā)生炎癥時，會促進誘導(dǎo)型一氧化氮酶(iNOS)的表達，使NO含量升高，進而激活環(huán)氧化酶2(COX-2)，誘導(dǎo)細胞凋亡[25-26]。Jung等[27]研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿素能夠通過調(diào)節(jié)NF-κB和STAT3下調(diào)iNOS和COX-2的表達，進而抑制LPS誘導(dǎo)下RAW264.7 細胞內(nèi)的NO和ROS含量。Shalini等[28-30]研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿素能夠顯著下調(diào)LPS刺激下人外周血單核細胞(hPBMCs)TNF-α、IL-6、PGE2 和 NO的生成，抑制 TLR4、MyD88 和TRIF 蛋白的活性；通過調(diào)節(jié)MAPK和PI3K/Akt 通路，下調(diào)NF-κB信號，降低COX-2 和TNF-α，提高人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的抗炎癥作用。另外，苜蓿素能夠顯著降低哮喘小鼠TNF-α、IL-1β和 NO水平，顯著降低肺泡巨噬細胞的TLR4、MyD88 和NF-κBp65mRNA和蛋白相對表達量[31]。本研究也發(fā)現(xiàn)，苜蓿素能夠顯著降低LPS誘導(dǎo)性奶牛乳腺上皮細胞TNF-α、IL-6、IL-1β、TLR4、TLR2的表達和 NO水平，說明苜蓿素發(fā)揮抗炎癥作用與其調(diào)控TRL4/MyD88/NF-κB 通路有關(guān)。

3.2 苜蓿素對乳蛋白合成的影響

乳蛋白是血液中游離氨基酸在乳腺上皮細胞中合成，而氨基酸進入細胞需要氨基酸轉(zhuǎn)運載體的參與。堿性氨基酸主要由氨基酸轉(zhuǎn)運載體CAT1進行轉(zhuǎn)運，而支鏈氨基酸、中性氨基酸和一些必需氨基酸則由LAT1轉(zhuǎn)運，因此，這兩種氨基酸轉(zhuǎn)運載體表達的高低能夠影響乳蛋白的合成。從本研究來看，在LPS刺激下，無論是否添加苜蓿素，均抑制氨基酸的轉(zhuǎn)運。將小鼠的JAK2和STAT5基因敲除，發(fā)現(xiàn)小鼠的乳腺腺泡發(fā)育不良，乳蛋白含量降低，酪氨酸磷酸化作用降低。激活的mTOR能夠抑制4EBP1發(fā)生磷酸化，促使eIF4E釋放4EBP1，進而促進蛋白質(zhì)的翻譯。mTOR還能夠促進S6K1磷酸化，增強含嘧啶基因mRNA的翻譯，進而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成[18,32]。因此，乳蛋白的合成受到JAK2-STAT5和mTOR信號通路的調(diào)控。劉立新等[33]研究發(fā)現(xiàn)，在LPS(>1 μg·mL-1)刺激下，奶牛乳腺上皮細胞的mTOR、S6K1、4EBP1 和STAT5 mRNA轉(zhuǎn)錄和相關(guān)蛋白的表達降低。本研究結(jié)果與其相似。然而張養(yǎng)東[14]發(fā)現(xiàn)，在LPS(0.1～1 ng·mL-1)刺激下，奶牛乳腺上皮細胞S6K1和4EBP1 mRNA的表達提高(P>0.05)，STAT5 mRNA 表達水平顯著提高(P<0.05)，而mTOR和JAK2 mRNA 的表達水平無變化。結(jié)果有所不同，可能是LPS添加劑量不同所致。在本研究中，在LPS刺激下，添加苜蓿素對mTOR、JAK2、S6K1和4EBP1的表達無顯著影響；而無LPS刺激下，添加苜蓿素能顯著上調(diào)mTOR、JAK2、STAT5、S6K1和4EBP1的表達。結(jié)果說明，苜蓿素可能會通過調(diào)控JAK2-STAT5和mTOR信號通路來促進乳蛋白的合成；LPS刺激下，乳蛋白合成會受阻，而添加苜蓿素對其影響不大。

4 結(jié)論

1)苜蓿素能夠提高奶牛乳腺上皮細胞的抗氧化能力，促進細胞的增殖；可能通過調(diào)控TRL4/MyD88/NF-κB 通路，降低炎癥因子的表達和NO的生成，進而發(fā)揮抗炎癥作用。

2)LPS通過調(diào)控JAK2-STAT5和mTOR信號通路來抑制乳蛋白合成，而苜蓿素可能通過調(diào)控JAK2-STAT5和mTOR信號通路來促進乳蛋白的合成。

References:

[1] Zhou J M，Ibrahim R K.Tricin：A potential multifunctional nutraceutical.Phytochemistry Reviews，2010，9(3)：413-424.

[2] Chung I M，Hahn S J，Ahmad A.Confirmation of potential herbicidal agents in hulls of rice,Oryzasativa.Journal of Chemical Ecology，2005，31(6)：1339-1352.

[3] Bichoff E M，Livingston A L，Booth A N.Tricin from alfalfa:Isolation and physiological activity.Journal of Pharmaceutical Sciences，1964，53：1411-1412.

[4] Verschoyle R D，Greaves P，Cai H，Broggini M，D’Incalci M，Riccio E，Doppalapudi R，Kapetanovic I M，Steward W P，Gescher A J.Preliminary safety evaluation of the putative cancer chemopreventive agent tricin,a naturally occurring flavone.Cancer Chemotherapy and Pharmacology，2006，57(1)：1-6.

[5] Yazawa K，Kurokawa M，Obuchi M，Li Y，Yamada R，Sadanari H，Matsubara K，Watanabe K，Koketsu M，Tuchida Y，Murayama T.Anti-influenza virus activity of tricin，4′，5，7-trihydroxy-3′，5′-dimethoxyflavone.Antiviral Chemistry & Chemotherapy，2011，22：1-11.

[6] Duarte-Almeida J M，Negri G，Salatino A，Carvalho J E，Lajolo F M.Antiproliferative and antioxidant activities of a tricin acylated glycoside from sugarcane (Saccharumofficinarum) juice.Phytochemistry，2007，68(8)：1165-1171.

[7] Gu J Q，Wang Y S，Montenegro G，Montenegro G，Yang D，Timmermann B N.Antitubercular constituents ofValerianalaxiflora.Planta Medica，2004，70(6)：509-514.

[8] 楊春，王國剛，王明利．我國的燕麥草生產(chǎn)和貿(mào)易.草業(yè)科學(xué)，2017，34(5)：1129-1135.

Yang C，Wang G G，Wang M L.Production and trade of wild oat forage in China.Pratacultural Science，2017，34(5)：1129-1135.(in Chinese)

[9] 左曉昕，姚丹丹，占今舜，趙國琦.苜蓿生物活性物質(zhì)在動物上的應(yīng)用.草業(yè)科學(xué)，2015，32(7)：1185-1191．

Zuo X X，Yao D D，Zhan J S，Zhao G Q.Application of bioactive substance in alfalfa on animals.Pratacultural Science，2015，32(7)：1185-1191．(in Chinese)

[10] Piotrowska-Tomala K K,Siemieniuch M J,Szóstek A Z,Korzekwa A J,Woclawek-Potocka I,Galváo A M,Okuda K,Skarzynski D J.Lipopolysaccharides,cytokines,and nitric oxide affect secretion of prostaglandins and leukotrienes by bovine mammary gland epithelial cells.Domestic Animal Endocrinology，2012，43(4)：278-288.

[11] Sun Y,Li L,Wu J,Yu P,Li C,Tang J,Li X,Huang S,Wang G.Bovine recombinant lipopolysaccharide binding protein (BRLBP) regulated apoptosis and inflammation response in lipopolysaccharide-challenged bovine mammary epithelial cells (BMEC).Molecular Immunology，2015，65(2)：205-214.

[12] Shi H，Guo Y，Liu Y，Shi B L，Guo X Y，Jin L，Yan S M.The in vitro effect of lipopolysaccharide on proliferation,inflammatory factors and antioxidant enzyme activity in bovine mammary epithelial cells.Animal Nutrition，2016，2(2)：99-104.

[13] 朱麗萍，楊文浩，任婷婷，叢霞，李華濤，曹榮峰，劉楚君，田文儒.脂多糖誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細胞中炎性因子和核轉(zhuǎn)錄子-κB的表達.中國獸醫(yī)雜志，2016，52(5)：14-17.

Zhu L P，Yang W H，Ren T T，Cong X，Li H T，Cao R F，Liu C J，Tian W R.The expression of NF-κB and IκB-α induced by LPS in bovine mammary epithelial cells.Chinese Journal of Veterinary Medicine，2016，52(5)：14-17.(in Chinese)

[14] 張養(yǎng)東.脂多糖對泌乳奶牛乳脂肪和乳蛋白影響及其機理研究.哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文，2011.

Zhang Y D.Effect of LPS on the milk fat and protein synthesis in dairy cows.PhD Thesis.Harbin:Northeast Agricultural University，2011.(in Chinese)

[15] 臧長江，張養(yǎng)東，王加啟，胡濤，卜登攀，金迪，周凌云，李發(fā)弟.脂多糖對泌乳奶牛乳中氨基酸組成及蛋白質(zhì)代謝相關(guān)基因表達的影響.動物營養(yǎng)學(xué)報，2012，24(9)：1770-1777.

Zang C J，Zhang Y D，Wang J Q，Hu T，Bu D P，Jin D，Zhou L Y，Li F D.Effects of lipolysacchride on amino acid composition and gene expressions related to protein metabolism in milk of dairy cows.Chinese Journal of Animal Nutrition，2012，24(9)：1770-1777.(in Chinese)

[16] 占今舜，魏明吉，蘇效雙，詹康，劉明美，張春剛，趙國琦.苜蓿黃酮對熱應(yīng)激下體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細胞凋亡的影響.草業(yè)學(xué)報，2016，25(4)：159-165.

Zhan J S，Wei M J，Su X S，Zhan K，Liu M M，Zhang C G，Zhao G Q．Effect of alfalfa flavonoids on bovine mammary epithelial cell cultures in vitro under heat stress.Acta Prataculturae Sinica，2016，25(4)：159-165.(in Chinese)

[17] Matsui T，Ichikawa H，F(xiàn)ujita T，Takagi T，Osada-Oka M，Minamiyama Y.Histidine deficiency attenuates cell viability in rat intestinal epithelial cells by apoptosis via mitochondrial dysfunction.Journal of Nutrition & Intermediary Metabolism，2017，8：21-28.

[18] 占今舜，劉明美，詹康，趙國琦.苜蓿黃酮對奶牛乳腺上皮細胞乳蛋白、乳脂和乳糖合成的影響.中國畜牧雜志，2017，53(1)：91-95.

Zhan J S，Liu M M，Zhan K，Zhao G Q．Effects of alfalfa flavonoids on lactoprotein,milk fat and lactose synthesis in bovine mammary epithelial cells.Chinese Journal of Animal Science，2017，53(1)：91-95.(in Chinese)

[19] 占今舜，吳力專，李麗立，張彬.金屬硫蛋白對熱應(yīng)激下體外培養(yǎng)奶牛淋巴細胞的影響.草業(yè)學(xué)報，2014，23(3)：215-223.

Zhan J S，Wu L Z，Li L L，Zhang B.Effect of metallothionein on lymphocyte apoptosis of the dairy cow cultured in vitro under heat stress.Acta Prataculturae Sinica，2014，23(3)：215-223.(in Chinese)

[20] 劉立新，林葉，張莉，李慶章.脂多糖對奶牛乳腺上皮細胞毒性作用及乳蛋白合成的影響.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2015，46(6)：61-66.

Liu L X，Lin Y，Zhang L，Li Q Z.Cytotoxicity of LPS and effects on milk protein synthesis in dairy cow mammary epithelial cells.Journal of Northeast Agricultural University，2015，46(6)：61-66.(in Chinese)

[21] 王亨，孟霞，邱昌偉，馬翀，李建基，齊長明.脂多糖誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細胞先天性免疫反應(yīng).中國獸醫(yī)學(xué)報，2010，30(3)：398-401.

Wang H，Meng X，Qiu C W，Ma C，Li J J，Qi C M.The innate immune responses of bovine mammary epithelial cells stimulated by lipopolysaccharide.Chinese Journal of Veterinary Science，2010，30(3)：398-401.(in Chinese)

[22] 蘇效雙，占今舜，詹康，劉明美，趙國琦.苜蓿黃酮對體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞增殖與抗氧化的影響.草業(yè)學(xué)報，2015，24(12)：139-145.

Su X S，Zhan J S，Zhan K，Liu M M，Zhao G Q．Proliferation stimulus and antioxidant effect of alfalfa flavonoids on dairy cow mammary epithelial cells cultured in vitro．Acta Prataculturae Sinica，2015，24(12)：139-145.(in Chinese)

[23] 劉春龍，李忠秋，張帆，姜文博，徐巖，單安山.大豆黃酮和染料木素對體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細胞增殖及抗氧化水平的影響.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2008，39(11)：1517-1522.

Liu C L，Li Z Q，Zhang F，Jiang W B，Xu Y，Shan A S.Effect of daidzein and genistein on proliferation and antioxidation of mammary epithelial cell of dairy cow in vitro.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2008，39(11)：1517-1522.(in Chinese)

[24] 牟瑛，季愛玲，曹瑞，劉寒強，王楓.二羥異黃酮和三羥異黃酮對CHO細胞抗氧化活性的比較研究.中國美容醫(yī)學(xué)雜志，2006，15(11)：1230-1232.

Mou Y，Ji A L，Cao R，Liu H Q，Wang F.Comparison of antioxidant activities to CHO cell between daidzein and genistein.Chinese Journal of Aesthetic Medicine，2006，15(11)：1230-1232.(in Chinese)

[25] Kang B M，An B K，Jung W S，Jung H K，Cho J H，Cho H W，Jang S J，Yun Y B，Kuk Y I.Anti-inflammatory effect of tricin isolated fromAlopecurusaequalisSobol.on the LPS-induced inflammatory response in RAW 264.7 cells.International Journal of Molecular Medicine，2016，38：1614-1620.

[26] Nguyen D H，Zhao B T，Le D D，Kim K Yun，Kim Y H，Yoon Y H，Ko J Y，Woo K S，Woo M H.Phenolic constituents and their anti-inflammatory activity fromEchinochloautilisGrains.Natural Product Sciences，2016，22(2)：140-145.

[27] Jung Y S，Kim D H，Hwang J Y，Yun N Y，Lee Y H，Han S B，Hwang B Y，Lee M S，Jeong H S，Hong J T.Anti-inflammatory effect of tricin 4′-O-(threo-β-guaiacylglyceryl) ether,a novel flavonolignan compound isolated from Njavara on in RAW264.7 cells and in ear mice edema.Toxicology and Applied Pharmacology，2014，277：67-76.

[28] Shalini V，Bhaskar S，Kumar K S，Mohanlal S，Jayalekshmy A，Helen A.Molecular mechanisms of anti-inflammatory action of the flavonoid,tricin from Njavara rice (OryzasativaL.) in human peripheral blood mononuclear cells：Possible role in the inflammatory signaling.International Immunopharmacology，2012，14：32-38.

[29] Shalini V，Jayalekshmy A，Helen A.Mechanism of anti-inflammatory effect of tricin,a flavonoid isolated from Njavara rice bran in LPS induced hPBMCs and carrageenan induced rats.Molecular Immunology，2015，66：229-239.

[30] Shalini V，Pushpan C K，Sindhu G，Jayalekshmy A，Helen A.Tricin,flavonoid from Njavara reduces inflammatory responses in hPBMCs by modulating the p38MAPK and PI3K/Akt pathways and prevents inflammation associated endothelial dysfunction in HUVECs.Immunobiology，2016，221：137-144.

[31] 殷玉婷，劉麗麗，劉利艷.苜蓿素對哮喘小鼠肺泡巨噬細胞TLR4/MyD88/NF-κB通路的抑制作用.中成藥，2017，39(3)：450-454.

Yin Y T，Liu L L，Liu L Y.Tricin’s inhibitory effects on TLR4/MyD88/NF-κB pathway of alveolar macrophages in asthma mice.Chinese Traditional Patent Medicine，2017，39(3)：450-454.(in Chinese)

[32] Inoki K，Ouyang H，Li Y，Guan K L.Signaling by target of rapamycin proteins in cell growth control.Microbiology & Molecular Biology Reviews，2005，69(1)：79-100.

[33] 劉立新，林葉，張莉，李慶章.脂多糖對奶牛乳腺上皮細胞毒性作用及乳蛋白合成的影響.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2015，46(6)：61-66.

Liu L X，Lin Y，Zhang L，Li Q Z.Cytotoxicity of LPS and effects on milk protein synthesis in dairy cow mammary epithelial cells.Journal of Northeast Agricultural University，2015，46(6)：61-66.(in Chinese)