李莎莎,李 紅,楊偉光,楊 曌,王曉龍,柴 華

(黑龍江省畜牧研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

苜蓿(Medicagosativa)具有較高的產(chǎn)量和較好的營養(yǎng)價值、適口性好等優(yōu)點，除此之外，苜蓿在農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)、植被恢復、水土保持、培肥地力、改良土壤等方面也具有重要的作用，有“牧草之王”、“草黃金”的美譽[1-3]。作為優(yōu)質的蛋白飼草，苜蓿被各國廣泛種植，苜蓿在美國的地位等同于糧食作物，種植面積僅次于玉米(Zeamays)、小麥(Triticumaestivum)和大豆(Glycinemax)[4]。苜蓿在我國的種植歷史悠久，據(jù)史料記載，我國的苜蓿種植始于漢代，引自西域，迄今已經(jīng)有兩千多年的歷史[5]。

數(shù)據(jù)顯示，全球超過1/3的土地處于干旱和半干旱狀態(tài)，我國有近一半的耕地處于干旱和半干旱狀態(tài)，干旱成為制約部分地區(qū)農業(yè)、經(jīng)濟、社會和生態(tài)發(fā)展的主要因素，干旱造成的影響最廣，造成的經(jīng)濟損失最大，被認為是世界上最嚴重的自然災害類型之一，也是制約我國農業(yè)發(fā)展的主要非生物脅迫之一[6-8]。依據(jù)《中國多年生栽培草種區(qū)劃》所劃分，我國苜蓿六大種植區(qū)大多集中在我國西北和東北干旱、半干旱區(qū)域，干旱是影響其產(chǎn)量的主要因素[9]?，F(xiàn)階段，國內的苜蓿良種短缺、缺乏優(yōu)質苜蓿產(chǎn)品，難以滿足國內生產(chǎn)需求，對國外進口苜蓿的依存度較高，極大地制約了我國苜蓿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[10-11]。國內育成的苜蓿品種主要以抗寒、抗病蟲、耐鹽堿、耐牧以及優(yōu)質高產(chǎn)為主，缺少抗旱品種[11]。紫花苜蓿抗旱的生理指標研究已經(jīng)非常深入，隨著生物技術研究的不斷發(fā)展，國內外學者對紫花苜?？购档难芯恳延缮頇C制轉向分子機理方面[12-13]。為此，本文通過對比光合呼吸系統(tǒng)、活性氧防御系統(tǒng)、滲透調節(jié)系統(tǒng)、脫落酸等在干旱脅迫下的變化分析苜蓿抵御干旱脅迫的生理機制，同時對轉錄因子、蛋白酶基因和抗旱基因在苜蓿干旱脅迫下的應答過程進行闡述，并對未來苜蓿應答干旱脅迫的研究重點進行展望，以期為苜蓿的抗旱研究提供理論基礎。

1 紫花苜?？购瞪硌芯?/h2>

1.1 光合呼吸與抗旱性

可利用的水資源對植物生長和光合作用的影響早期已有廣泛的研究[14-16]。干旱會引發(fā)植物水分虧缺，從而影響植物的正常生長，促進細胞衰老，嚴重時甚至會導致植物死亡；干旱還通過一系列的途徑抑制光合作用，如抑制葉片的伸展、降低葉綠體的活性等，從而影響植物的生長發(fā)育[17-18]。作為光合作用的必要條件之一，葉綠素也可作為抗旱指標，干旱通過影響葉綠素的生物合成過程以及促進合成的葉綠素加速分解等過程，導致植物葉片葉綠素含量降低[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫在一定程度上降低了葉綠素a、葉綠素b的含量以及葉綠素總量，減慢了光化學效率，同時顯著增加了葉片丙二醛和脯氨酸含量[17]。韓瑞宏等[20]對兩種抗旱性不同的紫花苜蓿進行干旱脅迫下光合生理研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫會造成兩種紫花苜蓿的凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導度、葉綠素含量不同程度的下降，并且葉綠體的超微結構已經(jīng)遭到破壞。同時該研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫還使光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)受到傷害，PSⅡ原初光能轉化效率降低，PSⅡ潛在活性中心受損，光合作用原初反應過程受到抑制。對干旱脅迫下不同羊草(Leymuschinensis)的反應研究時發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下，不同品種羊草的光合速率均有降低的趨勢，且不同品種的羊草的凈光合速率變化差異顯著[21]。

1.2 活性氧防御系統(tǒng)與抗旱性

活性氧在植物應對非生物脅迫中扮演了一個重要的角色，它既是脅迫下新陳代謝的有毒副產(chǎn)物，同時也是一種重要的信號轉導分子[22]。植物通過不同細胞間多重通路微妙的調節(jié)來適應環(huán)境，一旦細胞或者植株暴露在水分或鹽脅迫等水勢急速下降的環(huán)境中，這種通路就會被打開，高能電子被轉移到分子氧上，形成活性氧，譬如，H2O2、·O2-、1O2、·OH、HO2·，過量的活性氧分子會對植物的蛋白質、DNA以及脂類物質等造成氧化損傷[23-26]。幾乎在所有的脅迫環(huán)境下，活性氧的積累和相關的氧化損傷都極大程度的被激活，導致細胞膜的不穩(wěn)定和嚴重的細胞傷害，甚至會導致細胞的死亡[25,27]。植物在正常的新陳代謝過程特別是脅迫環(huán)境中必不可少的是活性氧的解除，植物抗氧化系統(tǒng)由抗氧化劑類和抗氧化酶類兩部分組成[28]?？寡趸瘎┲饕锌箟难?AsA)、谷胱甘肽(GSH)、甘露醇、α-生育酚等，活性氧清除酶類主要有超氧化物歧化酶(SOD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、過氧化物氧化還原酶(PRDX)[24,26,28-30]。植物體內的抗氧化劑以及活性氧清除酶將植物體內產(chǎn)生的多余活性氧分子通過一系列生理生化反應轉化成H2O和O2(圖1)。研究表明，抗旱性強的苜蓿品種，在干旱條件下的草產(chǎn)量較高，并且其葉片的CAT、POD及SOD的活性存有率也高[31]。在對根莖型、直根型和根蘗型苜蓿苗期受干旱脅迫的生理耐受分析試驗中發(fā)現(xiàn)，不同根型苜蓿的SOD活性都隨著干旱程度的增加而升高[32]。在對干旱條件下接種根瘤菌與不接種根瘤菌的苜?？购瞪碇笜诉M行測定時發(fā)現(xiàn)，接種根瘤菌與否，紫花苜蓿根、莖、葉中GSH含量及SOD和POD活性都隨著干旱時間的延長而不斷升高[33]。利用不同濃度的PEG-6000溶液對12種抗旱性不同的苜蓿品種進行滲透脅迫處理，結果顯示，12個苜蓿品種的幼苗在一定的PEG濃度下其POD、CAT和SOD活性均呈現(xiàn)增加的趨勢[34]。

1.3 滲透調節(jié)與抗旱性

滲透調節(jié)是植物在干旱條件下維持植物有效生長膨壓的基本生理機制。最近，研究人員指出滲透調節(jié)最主要的避免脫水的機制是積累溶質和細胞壁硬化[35]。這種可溶性物質的積累既不會破壞細胞代謝過程的平衡，而且在細胞質濃度高的情況下也是無毒的，以此來降低細胞的滲透勢，從而使得植物在較低水勢的生長介質中也能吸收水分(圖2)。植物體內積累的滲透調節(jié)物質主要包括無機離子、多元醇和可溶性糖類、可溶性蛋白、植物激素、氨基酸及其衍生物和甲胺類化合物[36-37]。研究中多以脯氨酸、甜菜堿、可溶性糖、可溶性蛋白等有機滲透調節(jié)物質作為抗逆生理指標。

脯氨酸在滲透調節(jié)中起著至關重要的作用，它不僅是重要的滲透保護劑，也可以作為分子伴侶、抗氧化劑、氧化還原平衡的調節(jié)器以及碳和氮的來源[38]。可溶性糖主要包括蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、果聚糖等，不同的植物在干旱脅迫下積累的糖分也會有差異?？扇苄缘鞍字饕信咛グl(fā)育晚期豐富蛋白(LEA蛋白)、脫水素、水孔蛋白等[37]。干旱脅迫下，脯氨酸的積累已經(jīng)在很多物種上被反復報道過[39]。Hatzig等[40]研究分析，油菜(Brassicacampestris)在體外滲透壓力下,主動積累滲透活性物質,如脯氨酸及可溶性碳水化合物等，這表明降低滲透勢是其應答干旱脅迫的一個主要的因素。對耐旱的苜蓿品種隴東、中等耐旱的公農1號以及不耐旱的BL-02-329進行干旱脅迫研究，結果顯示，3種紫花苜蓿的脯氨酸以及可溶性糖含量在一定時間內隨脅迫時間的延長呈上升的趨勢且總量也逐漸增加[41]。接種根瘤菌與不接種根瘤菌的紫花苜蓿莖、葉中的脯氨酸含量和可溶性糖含量均隨干旱時間的延長而增加[33]。利用SDS-PAGE電泳分析法對8個抗旱性強和7個抗旱性弱的苜蓿品種進行干旱脅迫下可溶性蛋白變化分析結果顯示，某些可溶性蛋白隨著干旱時間的延長呈現(xiàn)先增加后減弱的趨勢；抗旱性較弱的品種產(chǎn)生的干旱誘導蛋白比抗旱性較強的品種少；干旱15 h時，抗旱性強的品種均被誘導產(chǎn)生新的蛋白而抗旱性弱的品種只有兩個品種出現(xiàn)新的蛋白，由此可見，可溶性蛋白的變化與干旱強度有直接的關系[42]。甜菜堿含量和甜菜堿醛脫氫酶活性在干旱脅迫下明顯增加，且不同的苜蓿品種間差異顯著[43]。

圖1 植物活性氧清除過程Fig. 1 Pathways of scavenging of reactive oxygen species in plants

根據(jù)文獻[25]整理繪制而成。

Modified by[25].

圖2 干旱脅迫下滲透調節(jié)過程Fig. 2 Pathways of osmotic adjustment under drought stress

1.4 脫落酸與抗旱性

脫落酸是植物在應答生物和非生物脅迫過程中調節(jié)生理和發(fā)育過程的重要的植物激素[44-47]。由一對保衛(wèi)細胞組成的氣孔不僅控制著與蒸騰作用相關的水分流失，同時還調節(jié)空氣與植物體內的O2和CO2的交換。保衛(wèi)細胞通過滲透作用控制氣孔的開閉。植物通過一系列復雜的信號網(wǎng)絡實現(xiàn)ABA調節(jié)氣孔關閉應答干旱脅迫，水分虧缺的狀態(tài)下，ABA促進氣孔的關閉，同時抑制氣孔的打開以此來減少水分的流失[48]。ABA在土壤水分虧缺的狀態(tài)下還能夠降低葉片的擴張率，同時通過降低膨壓、細胞分裂速率和細胞壁的擴展性來降低空氣濕度[49-51]。干旱脅迫開始后，紫花苜蓿根部ABA含量隨干旱脅迫時間的延長呈上升的趨勢，干旱6 h達到最高，而葉片中的ABA含量在干旱3 h后也高于未脅迫的對照組[52]。對兩種不同抗旱性的苜蓿品種進行干旱處理，研究結果顯示，不同抗旱性的兩種苜蓿品種的ABA含量均隨干旱時間的延長而升高[41]。

2 苜?？购档姆肿訖C制研究

植物依賴抗旱相關基因的調控抵御各種生物脅迫以及非生物脅迫，近年來，部分苜?？购迪嚓P轉錄因子基因、酶基因等相繼被找到(表1)。

2.1 轉錄因子與抗旱性

干旱應答結合元件(DREB)是一種與非生物脅迫相關的轉錄因子，對植物抗逆性起著非常重要的作用，目前已成功克隆了可能與蛋白抗逆功能相關的紫花苜蓿DREB1基因，并對其編碼的蛋白的理化性質、二級以及三級結構進行了分析[53]。陳李淼等[64]成功克隆了一個大豆脫水脅迫響應相關的bHLH類轉錄因子GmbHLH25，該轉錄因子與苜蓿同源蛋白關系最近，并將GmbHLH25基因轉入到煙草(Nicotianatabacum)中，在干旱、高鹽脅迫下超表達能夠提高煙草的耐旱、抗鹽的能力。NAC(NAM、ATAF1/2、CUC2)是最大的植物特定轉錄因子家族之一，在植物生長發(fā)育和響應環(huán)境脅迫方面起重要作用。以SSH-cDNA文庫中紫花苜蓿的一個503 bp的EST片段為基礎，克隆了一個新的NAC基因，它全長1 115 bp，包括一個816 bp的ORF，能夠編碼271個氨基酸，在不同的干旱脅迫時間進行實時相對定量分析(RT-PCR)，結果顯示，該基因可以被干旱、高鹽以及ABA誘導轉錄表達，并且轉入該基因的擬南芥(Arabidopsisthaliana)比野生型具有更強的抗旱性[54]。在野生大豆(Glycinesoja)中發(fā)現(xiàn)了一種能夠編碼WRKY類轉錄因子的基因GsWRKY25，將該基因轉入到擬南芥中超表達，結果顯示，能夠增加擬南芥的抗旱性，隨后將該基因成功轉入到紫花苜蓿中超表達，將轉基因苜蓿種植到鹽堿地以及水分虧缺的條件下，野生型苜蓿表現(xiàn)出葉片萎黃病、生長遲緩甚至死亡，轉基因苜蓿則表現(xiàn)出較低的相對膜透性和丙二醛含量、較多的脯氨酸和可溶性糖積累，此外，轉基因苜蓿還具有較厚的角質層，能夠減少水分虧缺時植物水分散失[55]。

“-”表示未命名。

“-” stands for “unnamed”.

2.2 蛋白酶基因與抗旱性

過氧化物酶是植物參與逆境脅迫重要的保護酶之一。張怡等[56]從紫花苜蓿中克隆出了過氧化物酶基因MsPOD，并將其轉入擬南芥中，RT-PCR和GUS染色顯示其在擬南芥中成功表達。將從朝鮮堿茅(Puccinelliachinampoensis)中克隆的控制植物脯氨酸合成的關鍵酶和限速酶基因PuP5CS通過農桿菌介導轉入紫花苜蓿，對轉化植株進行PCR和RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，該基因在RNA水平上正常表達[57]。玉米黃質環(huán)氧酶(ZEP)因其在脫落酸生物合成和葉黃素循環(huán)中的作用，在植物非生物脅迫中扮演者重要的角色。Zhang等[58]克隆了一個全長1 992 bp，能夠編碼663個氨基酸的苜蓿ZEP基因，命名為MsZEP，通過氨基酸序列對比發(fā)現(xiàn)其與其他植物高度同源，通過在煙草中進行超表達發(fā)現(xiàn)，該基因在莖葉中的表達量要顯著大于在根中的表達量，干旱以及鹽脅迫下，該基因通過影響各種生理途徑、脫落酸水平以及脅迫應答基因的表達來抵御脅迫。紫花苜蓿中存在一種促分裂原活化蛋白激酶(MAP激酶)MMK4(MedicagoMAP Kinase 4)，干旱脅迫可誘導MMK4基因轉錄水平的增加，表明其活性是翻譯后水平調控[59]。二磷酸核苷激酶(NDPKs)是一類蛋白激酶家族，它的主要功能是維持除了三磷酸腺苷以外的其他核苷三磷酸分子內水平的生物合成，植物NDPKs的異位表達顯示其是一種能夠參與許多重要的細胞過程的多功能蛋白質，如，植物生長與發(fā)育的監(jiān)管、響應光敏色素A的信號轉導、紫外線B輻射、熱應激、H2O2調節(jié)的氧化脅迫等。此外，它在抵抗非生物脅迫過程中起著重要的作用。在擬南芥的NDPKs的3個亞型中，NDPK2與抵御非生物脅迫息息相關。擬南芥的NDPK2是光敏色素調節(jié)光信號通路的一個積極的信號組件，還參與植物H2O2調節(jié)的促分裂原活化蛋白激酶信號傳導。紫花苜蓿超表達擬南芥二磷酸核苷激酶2(AtNDPK2)基因植株在鹽脅迫和水分脅迫下比非轉基因植株表現(xiàn)出較高的耐受能力，此外轉基因植株通過增強表達生長激素相關的吲哚乙酸基因(MsIAA3、MsIAA5、MsIAA6、MsIAA7、MsIAA16)，比非轉基因植株具有的更好的生長性[60]。

2.3 苜蓿超表達抗旱基因

包愛科和王鎖民[61]將擬南芥液泡膜H+-PPase基因AVP1通過農桿菌介導轉化法導入新疆大葉苜蓿中表達，同時對表達水平最高和最低的兩個轉基因系列進行抗逆性檢測，結果顯示轉基因苜蓿的耐鹽性和抗旱性比野生型顯著增強。李燕等[62]將目標基因MsZIP成功轉入到紫花苜蓿中進行超表達，然后用25 μmol·L-1PEG-6000處理轉基因苜蓿并測定生理指標，結果顯示,轉基因組與未轉基因對照組可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量均增加，但轉基因組紫花苜蓿增幅較大，兩組的丙二醛含量顯著增加，但轉基因組增幅比未轉基因的要小，說明MsZIP基因在紫花苜蓿中的超表達能提高苜蓿的耐旱性。水通道蛋白調節(jié)水分和其他小分子通過液泡和細胞質膜，是高度多樣化的蛋白家族，他們與植物的生物和非生物脅迫都息息相關[65]。SNAREs蛋白是一類對植物體內物質運輸起著重要作用的蛋白質家族。從紫花苜蓿中克隆了cDNA全長1 396 bp，能夠編碼418個氨基酸的MsSNARE基因，qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，該基因在苜蓿根莖葉內均有表達，且該基因在干旱脅迫時表達水平上調[63]。

3 結論與展望

隨著我國草畜一體化進程的發(fā)展，國內對優(yōu)質牧草，尤其是苜蓿的需求量越來越大。然而苜蓿在我國的種植環(huán)境仍未得到較大的改善，干旱仍是限制其產(chǎn)量和品質的主要因素之一。越來越多的研究者將目光轉向了苜?？购笛芯?，大量研究發(fā)現(xiàn)，苜?？购凳怯梢幌盗械纳砩磻约芭c干旱脅迫相關的基因誘導表達調控的結果(圖3)。干旱條件下，紫花苜蓿光合呼吸受到較大的影響，凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導度、葉綠素含量以及光合系統(tǒng)都不同程度的受到影響，直接影響其生長。水分虧缺的時候，苜蓿體內的活性氧含量升高，造成氧化損傷，同時苜蓿體內的活性氧防御系統(tǒng)會啟動，抗氧化劑含量升高，在一定程度上降低氧化損傷。同時，苜蓿體內的滲透調節(jié)物質以及植物激素水平升高，使其盡可能多的從外界環(huán)境中吸收水分,同時減少植物體內水分的流失。而這一切生理水平的變化都是由基因控制的，部分抗旱應答元件、轉錄因子以及抗旱基因相繼被找到，部分基因超表達顯示可以改善苜蓿的抗旱性。但是苜蓿的抗旱并不是由單一的基因控制，多基因如何協(xié)同抗旱，這些目前仍不明確。干旱脅迫后苜?？购祷蛉绾螁印⑿盘柸绾蝹鲗?，目前的研究中鮮有報道。苜蓿復雜的抗旱機制還有很多的未知需要不斷探索，更多的功能性蛋白以及抗旱應答元件仍需不斷研究和發(fā)現(xiàn)。隨著我國基因工程技術的迅猛發(fā)展，抗逆基因與生物工程技術的結合，將為苜蓿的抗旱育種工作提供更多的可能。

圖3 苜?？购瞪頇C制Fig. 3 Physiological mechanism of alfalfa drought resistance in alfalfa

References:

[1] 洪紱曾.苜?？茖W.北京:中國農業(yè)出版社,2009:147-148.

Hong F Z.Alfalfa Science.Beijing:China Agriculture Press,2009:147-148.(in Chinese)

[2] 李莎莎,張志強,王亞芳,張攀,曹玉曼,楊培志,呼天明.根瘤菌共生對低溫脅迫下紫花苜蓿抗寒生理變化的影響.草地學報,2016,24(2):377-383.

Li S S,Zhang Z Q,Wang Y F,Zhang P,Cao Y M,Yang P Z,Hu T M.Effect of symbiotic rhizobium in alfalfa on physiological change under cold stress.Acta Agrestia Sinica,2016,24(2):377-383.(in Chinese)

[3] 李平,孫杰,邢建軍.論苜蓿的起源與傳播.內蒙古草業(yè),2012,24(1):5-8.

Li P,Sun J,Xing J J.The origin and spread of alfalfa.Inner Mongolia Prataculture,2012,24(1):5-8.(in Chinese)

[4] 劉玉鳳,王明利,胡向東,石自忠.美國苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展及其對中國的啟示.農業(yè)展望,2014(8):49-54.

Liu Y F,Wang M L,Hu X D,Shi Z Z.Alfalfa industry development of america and its enlightenment to China.Agricultural Outlook,2014(8):49-54.(in Chinese)

[5] 孫啟忠,柳茜,那亞,李峰,陶雅.我國漢代苜蓿引入者考.草業(yè)學報,2016,25(1):240-253.

Sun Q Z,Liu Q,Na Y,Li F,Tao Y.The history of the introduction of alfalfa to China in the Han dynasty.Acta Prataculturae Sinica,2016,25(1):240-253.(in Chinese)

[6] 姜華,畢玉芬,陳連仙,單貴蓮,何承剛.旱作條件下紫花苜蓿生理特性的研究.草地學報,2012,20(6):1077-1080.

Jiang H,Bi Y F,Chen L X,Shan G L,He C G.Physiological characteristics of alfalfa under dry-farming conditions.Acta Agrestia Sinica,2012,20(6):1077-1080.(in Chinese)

[7] 李磊,賈志清,朱雅娟,綦艷林.我國干旱區(qū)植物抗旱機理研究進展.中國沙漠,2010,30(5):1053-1059.

Li L,Jia Z Q,Zhu Y J,Qi Y L.Research advances on drought resistance mechanism of plant species in arid area of China.Journal of Desert Research,2010,30(5):1053-1059.(in Chinese)

[8] 張俊,陳桂亞,楊文發(fā).國內外干旱研究進展綜述.人民長江,2011,42(10):65-69.

Zhang J,Chen G Y,Yang W F.Summary of advancement of drought study at home and abroad.Yangtze River,2011,42(10):65-69.(in Chinese)

[9] 楊青川,康俊梅,張鐵軍,劉鳳歧,龍瑞才,孫彥.苜蓿種質資源的分布、育種與利用.科學通報,2016,61(2):261-270.

Yang Q C,Kang J M,Zhang T J,Liu F Q,Long R C,Sun Y.Distribution,breeding and utilization of alfalfa germplasm resources.Chinese Science Bulletin,2016,61(2):261-270.(in Chinese)

[10] 江影舟,張潔冰,南志標,王麗佳.中國苜蓿國際貿易競爭力分析.草業(yè)科學,2016,33(2):322-329.

Jiang Y Z,Zhang J B,Nan Z B,Wang L J.Competitiveness analysis of alfalfa international trade in China.Pratacultural Science,2016,33(2):322-329.(in Chinese)

[11] 王雪,李志萍,孫建軍,馮長松,李紹鈺.中國苜蓿品種的選育與研究.草業(yè)科學,2014,31(3):512-518.

Wang X,Li Z P,Sun J J,Feng C S,Li S Y.Progress of alfalfa breeding in China.Pratacultural Science,2014,31(3):512-518.(in Chinese)

[12] Chaves M,Maroco J,Pereira J.Understanding plant responses to drought-from gene to the whole plant.Functional Plant Biology,2003,30(3):239-264.

[13] Shao H B,Guo Q J,Chu L Y,Zhao X N,Su Z L,Hu Y C,Cheng J F.Understanding molecular mechanism of higher plant plasticity under abiotic stress.Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2007,54(1):37-45.

[14] Bushby H V A.Ecology.//Broughton W J.Nitrogen Fixation Rhizobium.Second Edition.Oxford,UK:Clarendon Press,1982:35-75.

[15] Fellows R J,Patterson R P,Raper C D,Harris D.Nodule activity and allocation of photosynthate of soybean during recovery from water stress.Plant Physiology,1987,84(1):456-460.

[16] Irigoyen J J,Emerich D W,Sínchez-Díaz M.Water stress induced changes in concentrations of proline and total soluble sugars in nodulated alfalfa (Medicagosativa) plants.Physiologia Plantarum,1992,84:55-60.

[17] 樊良新,劉國彬,薛萐,楊婷,張昌勝.CO2濃度倍增及干旱脅迫對紫花苜蓿光合生理特性的協(xié)同影響.草地學報,2014,22(1):85-93.

Fan L X,Liu G B,Xue J,Yang T,Zhang C S.Synergistic effects of doubled CO2concentration and drought stress on the photosynthetic characteristics ofMedicagosativa.Acta Agrestia Sinica,2014,22(1):85-93.(in Chinese)

[18] Azrianingsih R,Arisoesilaningsih E,Isagi Y,Nakagoshi N.Responses ofCyperusbrevifolius(Rottb.)Hassk. andCyperuskyllingiaEndl. to varying soil water availability.Environmental Experimental Botany,2005,53(3):259-269.

[19] 李德全,鄒琦,程炳崇.土壤干旱下不同抗旱性小麥品種的滲透調節(jié)和滲透調節(jié)物質.植物生理學報,1992,18(1):37-44.

Li D Q,Zou Q,Cheng B C.Osmotic adjustment and osmotic of wheat cultivars with different drought resistance under soil drought.Acta Phytophysiologica Sinica,1992,18(1):37-44.(in Chinese)

[20] 韓瑞宏,盧欣石,高桂娟,楊秀娟.紫花苜蓿(Medicagosativa)對干旱脅迫的光合生理響應.生態(tài)學報,2007,27(12):5229-5237.

Han R H,Lu X S,Gao G J,Yang X J.Photosynthetic physiological response of alfalfa (Medicagosativa) to drought stress.Acta Ecologica Sinica,2007,27(12):5229-5237.(in Chinese)

[21] 劉惠芬,高玉葆,張強,李長林.土壤干旱脅迫對不同種群羊草光合及葉綠素熒光的影響.環(huán)境科學學報,2005,24(2):209-213.

Liu H F,Gao Y B,Zhang Q,Li C L.Effect of drought stress on photosynthesis and chlorophyll fluorescence for differentLeymuschinensispopulations.Journal of Agro-environment Science,2005,24(2):209-213.(in Chinese)

[22] Mittler R,Vanderauwera S,Suzuki N,Miller G,Tognetti V B,Vandepoele K,Gollery M,Shulaev V,Breusegem F V.ROS signaling:The new wave.Trends in Plant Science,2011,16(6):1360-1385.

[23] Mittler R,Kim Y,Song L,Coutu J,Coutu A,Ciftci-Yilmaz S,Lee H,Stevenson B,Zhu J K.Gain- and loss-of-function mutations in Zat10 enhance the tolerance of plants to abiotic stress.Federation of European Biochemical Societies Letters,2006,580(28):6537-6542.

[24] Takahashi M,Asada K.Superoxide production in aprotic interior of chloroplast thylakoids.Archives of Biochemistry and Biophysics,1988,267(2):714-722.

[25] Mittler R.Oxidative stress,antioxidants and stress tolerance.Trends in Plant Science,2002,7(9):405-410.

[26] Apel K,Hirt H.Reactive oxygen species: Metabolism,oxidative stress,and signal transduction.Annual Review of Plant Biology,2004,55:373-399.

[27] Miller G,Suzuki N,Ciftci-Yilmaz S,Mittler R.Reactive oxygen species homeostasis and signalling during drought and salinity stresses.Plant Cell and Environment,2010,33(4):453-467.

[28] 杜秀敏,殷文璇,趙彥修,張慧.植物中活性氧的產(chǎn)生及清除機制.生物工程學報,2001,17(2):121-125.

Du X M,Yin W X,Zhao Y X,Zhang H.The production and scavenging of reactive oxygen species in plants.Chinese Journal of Biotechnology,2001,17(2):121-125. (in Chinese)

[29] Mittler R,Vanderauwera S,Gollery M,Van Breusegem F.Reactive oxygen gene network of plants.Trends in Plant Science,2004,9(10):490-498.

[30] Dietz K J,Jacob S,Oelze M L,Laxa M,Tognetti V,de Miranda S M,Baier M,Finkemeier I.The function of peroxiredoxins in plant organelle redox metabolism.Journal of Experimental Botany,2006,57(8):1697-1709.

[31] 張新蘭.不同品種苜蓿葉片離體干旱脅迫過程中抗氧化酶活性動態(tài).草業(yè)科學,2008,25(2):77-83.

Zhang X L.Study on activity of antioxidative enzymes and drought resistance of alfalfa leaf under drought stress.Pratacultural Science,2008,25(2):77-83.(in Chinese)

[32] 南麗麗,師尚禮,朱新強,趙文翰,韓露,田晨霞.不同根型苜蓿苗期對干旱脅迫的生理耐受性分析.干旱地區(qū)農業(yè)研究,2011,29(5):106-110.

Nan L L,Shi S L,Zhu X Q,Zhao W H,Han L,Tian C X.Physiological change of different root types of alfalfa under drought stress at seedling stage.Agricultural Research in the Arid Areas,2011,29(5):106-110.(in Chinese)

[33] 張攀,楊培志,王衛(wèi)棟,張志強,韓博,王亞芳,曹玉曼,呼天明.干旱脅迫下根瘤菌共生紫花苜?？购瞪碜兓芯?草地學報,2013,21(5):938-944.

Zhang P,Yang P Z,Wang W D,Zhang Z Q,Han B,Wang Y F,Cao Y M,Hu T M.Study on physiological change of alfalfa with symbiotic rhizobium under drought stress.Acta Agrestia Sinica,2013,21(5):938-944.(in Chinese)

[34] 李紅,李波,馬赫,李祥利.模擬干旱脅迫對苜蓿幼苗抗氧化酶系統(tǒng)的影響.草原與草坪,2016,36(4):54-58.

Li H,Li B,Ma H,Li X L.Effect on antioxidative enzymes of alfalfa seedlings under simulated drought.Grassland and Turf,2016,36(4):54-58.(in Chinese)

[35] Verslues P E,Agarwal M,Katiyar-Agarwal S,Zhu J,Zhu J K.Methods and concepts in quantifying resistance to drought,salt and freezing,abiotic stresses that affect plant water status.The Plant Journal,2006,45(4):523-539.

[36] 劉振英,葉央芳,李竹.有機小分子滲透調節(jié)物質及其保護功能.生命科學,2013,25(4):410-415.

Liu Z Y,Ye Y F,Li Z.Low-molecular-weight organic osmolytes and their protective functions.Chinese Bulletin of Life Sciences,2013,25(4):410-415.(in Chinese)

[37] 郭華軍.水分脅迫過程中的滲透調節(jié)物質及其研究進展.安徽農業(yè)科學,2010,38(15):7750-7753,7760.

Guo H J.Research progress on osmotic adjustment material under water stress.Journal of Anhui Agricultural Sciences,2010,38(15):7750-7753,7760.(in Chinese)

[38] Szabados L,Savouré A.Proline:A multifunctional amino acid.Trends in Plant Science,2010,15(2):89-97.

[39] Pospisilova1 J,Haisel1 D,Vankova R.Responses of transgenic tobacco plants with increased proline content to drought and/or heat stress.American Journal of Plant Sciences,2011,2(3):318-324.

[40] Hatzig S,Zaharia L I,Abrams S,Hohmann M,Legoahec L,Bouchereau A,Nesi N,Snowdon R J.Early osmotic adjustment responses in drought-resistant and drought-sensitive oilseed rape.Journal of Integrative Plant Biology,2014,56(8):797-809.

[41] 韓瑞宏,張亞光,田華,盧欣石.干旱脅迫下紫花苜蓿葉片幾種內源激素的變化.華北農學報,2008,23(3):81-84.

Han R H,Zhang Y G,Tian H,Lu X S.Study on changes of endogenous hormones in the leaves of alfalfa under drought stress.Acta Agriculturae Boreali-Sinica,2008,23(3):81-84.(in Chinese)

[42] 康俊梅,楊青川,樊奮成.干旱對苜蓿葉片可溶性蛋白的影響.草地學報,2005,13(3):199-202.

Kang J M,Yang Q C,Fan F C.Effects of drought stress on induced protein in the differen drought resistance alfalfa leaf.Acta Agrestia Sinica,2005,13(3):199-202.(in Chinese)

[43] 趙金梅,周禾,王秀艷.水分脅迫下苜蓿品種抗旱生理生化指標變化及其相互關系.草地學報,2005,13(3):184-189.

Zhang J M,Zhou H,Wang X Y.Effect of water stress on physiological and biochemical process of alfalfa varieties.Acta Agrestia Sinica,2005,13(3):184-189.(in Chinese)

[44] Assmann S M,Wang X Q.From milliseconds to millions of years:Guard cells and environmental responses.Current Opinion in Plant Biology,2001,4(5):421-428.

[45] Yamaguchi-Shinozaki K,Shinozaki K.Transcriptional regulatory networks in cellular responses and tolerance to dehydration and cold stresses.Annual Review of Plant Biology,2006,57:781-803.

[46] Acharya B R,Assmann S M.Hormone interactions in stomatal function.Plant Molecular Biology,2009,69(4):451-462.

[47] Alvarez S,Roy Choudhury S,Hicks L M,Pandey S.Quantitative proteomics-based analysis supports a significant role of GTG proteins in regulation of ABA response inArabidopsisroots.Journal of Proteome Research,2013,12(3):1487-1501.

[48] Acharya B R,Jeon B W,Zhang Wei,Assmann S M.Open stomata 1 (OST1) is limiting in abscisic acid responses ofArabidopsisguard cells.New Phytologist,2013,200(4):1049-1063.

[49] Bacon M A,Wilkinson S,Davies W J.pH-regulated leaf cell expansion in droughted plants is abscisic acid dependent.Plant Physiology,1998,118(4):1507-1515.

[50] Cosgrove D J.Growth of the plant cell wall.Nature Reviews Molecular Cell Biology,2005,6(11):850-861.

[51] Tardieu F.Plant response to environmental conditions:Assessing potential production,water demand and negative effects of water deficit.Frontiers in Physiology,2013,4(17):1-11.

[52] 任敏,何金環(huán).自然干旱脅迫下紫花苜蓿葉片和根部ABA的代謝變化.安徽農業(yè)科學,2010,38(4):1771-1772.

Ren M,He J H.Changes of ABA metabolism in leaves and roots of alfalfa under natural drought stress.Journal of Anhui Agricultural Sciences,2010,38(4):1771-1772.(in Chinese)

[53] 謝健,王嘯,冉雪琴,王嘉福.紫花苜蓿DREB1轉錄因子基因的克隆及序列分析.畜牧與獸醫(yī),2013,45(7):45-49.

Xie J,Tian X,Ran X Q,Wang J F.Cloning and sequence analysis on alfalfa DREB1 transcription factor gene.Animal Husbandry & Veterinary Medicine,2013,45(7):45-49.(in Chinese)

[54] Wang Y X.Characterization of a novelMedicagosativaNAC transcription factor gene involved in response to drought stress.Molecular Biology Reports,2013,40(11):6451-6458.

[55] Tang L L,Cai H,Zhai H,Luo X,Wang Z Y,Cui L,Bai X.Overexpression ofGlycinesojaWRKY20 enhances both drought and salt tolerance in transgenic alfalfa (MedicagosativaL.).Plant Cell,Tissue and Organ Culture,2014,118(1):77-86.

[56] 張怡,康俊梅,楊青川,晁躍輝,張鐵軍,金洪.紫花苜蓿MsPOD基因的克隆及對擬南芥的轉化.中國草地學報，2013,35(3):6-11.

Zhang Y,Kang J M,Yang Q C,Chao Y H,Zhang T J,Jin H.Cloning ofMsPODgene from alfalfa(MedicagosativaL.) and the transpormation ofArabidopsisthaliana.Chinese Journal of Grassland,2013,35(3):6-11.(in Chinese)

[57] 徐博,任偉,王英哲,孫啟忠,郭瑋,婁玉杰.農桿菌介導的朝鮮堿茅PuP5CS基因轉化紫花苜蓿的研究.草業(yè)科學,2015,32(6):895-901.

Xu B,Ren W,Wang Y Z,Sun Q Z,Guo W,Lou Y J.Transformation ofPuccinelliachinampoensisPuP5CSgene into alfalfa withAgrobacterium-mediated method.Pratacultural Science,2015,32(6):895-901.(in Chinese)

[58] Zhang Z Q,Wang Y F,Chang L Q,Zhang T,An J,Liu Y S,Cao Y M,Zhao X,Sha X Y,Hu T M,Yang P Z.MsZEP,a novel zeaxanthin epoxidase gene from alfalfa (Medicagosativa),confers drought and salt tolerance in transgenic tobacco.Plant Cell Reports,2016,35(2):439-453.

[59] Jonak C,Kegerl S,Ligterink W,Barker P J,Huskisson N S,Hirt H.Stress signaling in plants:A mitogen-activated protein kinase pathway is activated by cold and drought.Proceedings of the National Academy of Sciences,1996,93(20):11274-11279.

[60] Wang Z,Li H B,Ke Q B,Jeong J C,Lee H C,Xu B C,Deng X P,Lim Y P,Kwak S S.Transgenic alfalfa plants expressingAtNDPK2 exhibit increased growth and tolerance to abiotic stresses.Plant Physiology and Biochemistry,2014(84):67-77.

[61] 包愛科,王鎖民.超表達植物H+-PPase基因提高紫花苜蓿的抗逆性.//第三屆中國苜蓿發(fā)展大會會議論文集.北京:中國畜牧業(yè)協(xié)會,2010:227-236.

Bao A K,Wang S M.Over-expression plantsH+-PPasegene enhance stress resistance of alfalfa.//The Third China National Alfalfa Industry Development Conference Proceedings.Beijing:China Animal Agriculture Association,2010:227-236.(in Chinese)

[62] 李燕,孫彥,楊青川,康俊梅,張鐵軍,房鋒.紫花苜蓿MsZIP基因超表達載體的構建及轉基因苜蓿檢測.草業(yè)學報,2012,21(6):182-189.

Li Y,Sun Y,Yang Q C,Kang J M,Zhang T J,Fang F.Construction and transformation of an over-expression plasmid of theMsZIPgene fromMedicagosativa.Acta Prataculturae Sinica,2012,21(6):182-189.(in Chinese)

[63] 張通.紫花苜蓿MsSNARE基因的克隆及表達分析.楊凌:西北農林科技大學碩士學位論文,2016.

Zhang T.Cloning and expression analysis ofMsSNAREgenes from alfalfa (MedicagosativaL.).Master Thesis.Yangling:North West Agriculture and Forestry University,2016.(in Chinese)

[64] 陳李淼,沙愛華,張嬋娟,單志慧,張曉娟,陳水蓮,朱曉玲,劉寶紅,祁琳,周新安,李文濱.一個大豆脫水脅迫響應的bHLH類轉錄因子的克隆及功能分析.中國油料作物學報,2013,35(6):630-636.

Chen L M,Sha A H,Zhang C J,Shan Z H,Zhang X J,Chen S L,Zhu X L,Liu B H,Qi L,Zhou X A,Li W B.Cloning and functioning analysis of transcription factor GmbHLH response to dehydration stress.Chinese Journal of Oil Crop Sciences,2013,35(6):630-636.(in Chinese)

[65] Li J,Ban L P,Wen H Y,Wang Z,Dzyubenko N,Chapurin V,Gao H W,Wang X M.An aquaporin protein is associated with drought stress tolerance.Biochemical and Biophysical Research Communications,2015,218(2):1-6.