劉 權(quán)，賀原花，李勇勝，劉暢宇，柳春梅，王有年，傅 華

(1.農(nóng)業(yè)部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020；2.農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(北方)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京農(nóng)學(xué)院，北京 102206)

人類(lèi)農(nóng)業(yè)史就是同各種病蟲(chóng)害作斗爭(zhēng)的歷史。近代化學(xué)農(nóng)藥曾風(fēng)靡一時(shí)，但是因?yàn)槠涓叨尽⒏邭埩艉鸵桩a(chǎn)生抗藥性，帶來(lái)了很多環(huán)境、生態(tài)和社會(huì)問(wèn)題[1-2]。以我國(guó)為例，每年農(nóng)作物病蟲(chóng)草害發(fā)生面積大約 4億hm2，農(nóng)藥已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中不可缺少的因素。然而,在農(nóng)藥廣泛使用對(duì)生產(chǎn)發(fā)展發(fā)揮重要作用的同時(shí)，也帶來(lái)“3R”等問(wèn)題，蟲(chóng)害、病害的抗藥性問(wèn)題 (resistance)、對(duì)環(huán)境的污染以及在農(nóng)畜產(chǎn)品中殘留和積累問(wèn)題(residue)、傷害天敵、破壞自然生態(tài)平衡、引起害蟲(chóng)再猖獗問(wèn)題(resurgence)等[2]。而植物源農(nóng)藥，是利用殺蟲(chóng)抑菌或除草活性的多種次生代謝物質(zhì)，這些物質(zhì)是植物與有害生物的相互適應(yīng)演變、協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果。植物源農(nóng)藥具有選擇性強(qiáng)、對(duì)特定的植物病蟲(chóng)害具有控制特效的特點(diǎn)，而且結(jié)構(gòu)新穎，活性位點(diǎn)多，不易產(chǎn)生抗藥性。此外，植物源農(nóng)藥的活性成分為天然物質(zhì)，在長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中已形成獨(dú)特的代謝降解途徑，在環(huán)境中不易殘留，對(duì)人和非靶標(biāo)生物安全，具有良好的環(huán)境相容性[3-4]。進(jìn)入 21世紀(jì)以來(lái), 環(huán)境和食品安全的問(wèn)題日益突出，植物源農(nóng)藥的研究和開(kāi)發(fā)越來(lái)越受到人們的重視。

白沙蒿(Artemisiasphaerocephala)是菊科蒿屬植物，又名圓頭沙蒿，廣泛分布于我國(guó)西北、華北和東北荒漠半荒漠地區(qū)，是流動(dòng)沙丘上的先鋒植物[5-6]。因常年生長(zhǎng)在荒漠地區(qū)，白沙蒿形成了對(duì)干旱、晝夜溫差大、光照輻射強(qiáng)度大和土壤貧瘠等多種不利因素獨(dú)特的適應(yīng)機(jī)制[7-11]，其次生代謝物在對(duì)環(huán)境的適應(yīng)和抗逆過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[11]。該植物的黃酮成分豐富，且具有較高的DPPH活性，有助于預(yù)防脅迫條件所引起的過(guò)量自由基給植物所帶來(lái)的損傷，提高環(huán)境適應(yīng)能力[11]。有研究報(bào)道，其次生代謝物，主要為橙皮素、柑橘素等黃酮成分，對(duì)植物病原真菌(如番茄灰霉霉病、番茄早疫病菌)有明顯抑制活性[12]，其丙酮提取物在24 h對(duì)粘蟲(chóng)(Mythimnaseparata)的拒食率達(dá)到68.8%[13]。

本研究首次開(kāi)展白沙蒿乙醇提取物對(duì)農(nóng)業(yè)害螨朱砂葉螨(Tetranychuscinnabarinus)和常見(jiàn)鱗翅目害蟲(chóng)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)(Spodopteralitura)的觸殺活性研究，并對(duì)農(nóng)作物和牧草幼苗生長(zhǎng)的植物毒活性進(jìn)行測(cè)試，以期為其作為植物源農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)和利用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 白沙蒿提取物的制備方法

將采自阿拉善地區(qū)(38°68′ N， 105°61′ E)的白沙蒿成熟期新鮮葉片，陰干，用球磨儀器(MM400，德國(guó)萊馳)粉碎，通過(guò)0.15 mm篩。將葉片細(xì)粉用20倍無(wú)水乙醇溶液浸泡，超聲波(KX700B，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)提取30 min后，重復(fù)提取2次，減壓濃縮提取液。在陰暗低溫和通風(fēng)較好的地方，晾干，制得提取物。

1.2 白沙蒿提取物的殺螨活性

將白沙蒿提取物先用含10%蒸餾水的丙酮(C3H6O)液配制成2 mg·mL-1濃度的母液，用蒸餾水將母液稀釋成1 000、500、333、250和200 μg·mL-1濃度的溶液待測(cè)。生物測(cè)定前加入1%的表面活性劑JFC(C7～C9烷醇聚氧乙烯醚)。

采用玻片浸漬法[14]。選用采自田間未施藥的黃豆(Glycinemax)苗上朱砂葉螨雌成螨。用零號(hào)毛筆挑選大小一致、體色鮮艷、行動(dòng)活潑的雌成螨，利用雙面膠將其背部粘在載玻片上，每片粘3行，每行粘10頭。在溫度25 ℃、濕度85%的生化培養(yǎng)箱(RXZ，寧波江南儀器廠)中放置4 h后，用雙目鏡(XSP-BM-2C，上海光學(xué)儀器廠)觀察，剔除死亡或不活潑個(gè)體。將帶螨玻片的一端浸入不同濃度的白沙蒿提取物溶液中，輕輕搖動(dòng)5 s 后取出，迅速用吸水紙吸干螨體及其周?chē)嘤嗟乃幰?。置于上述生化培養(yǎng)箱中，24 h后用雙目鏡檢查死亡數(shù)，計(jì)算死亡率。用毛筆輕觸螨體，以螨足不動(dòng)者為死亡。以含10%蒸餾水的丙酮空白溶液稀釋同樣倍數(shù)后加入JFC活性劑作為對(duì)照處理。每個(gè)濃度測(cè)定平行進(jìn)行3次，取其平均值。以魚(yú)藤酮(圖1)作為活性對(duì)照，因該化合物活性較高，所以測(cè)試濃度從500 μg·mL-1開(kāi)始。

1.3 白沙蒿提取物對(duì)斜紋夜蛾的殺蟲(chóng)活性

供試蟲(chóng)種采自田間未施藥甘藍(lán)(Brassicaolera-cea)上。待其卵孵化后，選取整齊一致的斜紋夜蛾成蟲(chóng)3齡初孵幼蟲(chóng)供試驗(yàn)用。采用蟲(chóng)體浸漬法。將白沙蒿提取物配制成10 mg·mL-1乙醇溶液，用蒸餾水稀釋成500倍和1 000倍。把3齡斜紋夜蛾幼蟲(chóng)放入已配好的白沙蒿提取物乙醇溶液中浸漬3 s后取出，放在濾紙上自然晾干后，放入人工氣候箱中 (RXZ，寧波江南儀器廠)，溫度 25 ℃，相對(duì)濕度為75%，日光照14 h用甘藍(lán)葉喂養(yǎng)。單次處理試蟲(chóng)20頭，重復(fù)3次，以稀釋的乙醇溶液做空白對(duì)照。藥后7、10和14 d檢查死蟲(chóng)，針尖觸碰蟲(chóng)體無(wú)反應(yīng)即記為死亡。

圖1 魚(yú)藤酮化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 The chemical structure of rotenone

1.4 白沙蒿提取物對(duì)其他植物的抑制活性

以常見(jiàn)的作物油菜(Brassicacampestris)和牧草苜蓿(Medicagosativa)、(Trifoliumpratense)、早熟禾(Poaannua)為試驗(yàn)對(duì)象。選用飽滿(mǎn)的種子，在無(wú)菌濾紙上培養(yǎng)發(fā)芽后，進(jìn)行植物毒活性試驗(yàn)[15]。

選取大小相仿的供試植物放入24孔板中，加入相同量的無(wú)菌水。將白沙蒿提取物分別配置成不同濃度的二甲基亞砜(DMSO)溶液，相同體積加入到孔板中，以加入同體積的DMSO為陰性對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。處理后觀察并記錄植物生長(zhǎng)情況。

油菜培養(yǎng)4 d，處理3 d；苜蓿培養(yǎng)3 d，處理4 d；紅三葉培養(yǎng)4 d，處理5 d；早熟禾培養(yǎng)10 d，處理5 d。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

殺蟲(chóng)活性計(jì)算公式如下：

相對(duì)死亡率=(對(duì)照組-處理組)/對(duì)照組×100%。

植物抑制率計(jì)算公式如下：

抑制率=(對(duì)照組-處理組)/對(duì)照組×100%。

采用SPSS 17.0軟件對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示測(cè)定結(jié)果，用Duncan法對(duì)各測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較；采用Excel 2010制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 白沙蒿提取物的殺蟲(chóng)活性

白沙蒿提取物對(duì)朱砂葉螨表現(xiàn)出較強(qiáng)的殺螨活性(表1)。在濃度為250 μg·mL-1時(shí)，殺螨活性接近于50%。經(jīng)過(guò)計(jì)算，魚(yú)藤酮的致死中濃度LC50為0.21 mg·mL-1，而白沙蒿提取物L(fēng)C50為0.31 mg·mL-1，在生產(chǎn)實(shí)踐中具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

白沙蒿提取物對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)表現(xiàn)出明顯的觸殺活性(表2)。結(jié)果表明，在處理10 d后，濃度為20 μg·mL-1時(shí)，殺蟲(chóng)活性大于50%。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，處理時(shí)間大于10 d時(shí)，白沙蒿對(duì)該幼蟲(chóng)的觸殺活性相對(duì)死亡率并沒(méi)有明顯變化。這可能是10 d后，作為植物提取物，其主要成分在自然條件下會(huì)發(fā)生一定程度的變化所致。

2.2 白沙蒿提取物的植物毒活性

白沙蒿提取物在200 μg·mL-1時(shí)，對(duì)油菜有明顯的抑制活性，主要影響其株高的生長(zhǎng)，且抑制率在20%以?xún)?nèi)；對(duì)苜蓿的鮮重有影響，抑制率在5%左右；對(duì)紅三葉和早熟禾無(wú)明顯抑制效果(圖2和圖3)。在較低的濃度下，該植物的提取物對(duì)不同植物的抑制作用均較小，而且對(duì)苜蓿和早熟禾的鮮重和株高有不同程度的促進(jìn)作用。

表1 白沙蒿提取物和魚(yú)藤酮對(duì)朱砂葉螨的殺螨活性Table 1 The acaricidal activities of Artemisia sphaerocephala and rotenone against Tetranychus cinnabarinus

同行不同小寫(xiě)字母表示不同濃度處理間差異顯著(P<0.05)。表2同。

Different lowercase letters within the same row indicate significant differences at the 0.05 level; similarly for Table 2.

3 討論與結(jié)論

蒿屬(Artemisia)是菊科(Compositae)春黃菊族(Anthemideae)的一個(gè)大屬，我國(guó)有186種、44變種，為我國(guó)種子植物中少有的大屬，其中約1/3的植物在民間被作為藥物使用[16]。白沙蒿是該屬中為數(shù)不多的生長(zhǎng)在荒漠地區(qū)的沙生半灌木，是荒漠植物的建群種之一[5-6]，形成了應(yīng)對(duì)荒漠極端氣候的獨(dú)特適應(yīng)機(jī)稍低于已商品化的植物源殺蟲(chóng)劑魚(yú)藤酮(LC50為0.21 mg·mL-1)。對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)的活性與現(xiàn)有合成農(nóng)藥相比，表現(xiàn)為緩殺效果，但對(duì)人或牲畜等非靶點(diǎn)生物是安全的，可長(zhǎng)期連續(xù)使用。

表2 白沙蒿提取物溶液對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性Table 2 The insecticidal activities of the extract from Artemisia sphaerocephala against Spodoptera litura

同行不同小寫(xiě)字母表示相同濃度不同處理時(shí)間差異顯著(P<0.05)。

Different lowercase letters for the same treatment concentrations indicate significant differences among different treatment time at the 0.05 level.

圖2 白沙蒿提取物對(duì)早熟禾的植物毒活性Fig. 2 Phytotoxic activities of the extract obtained from Artemisia sphaerocephala against bluegrass

制。該屬中的植物被報(bào)道具有殺蟲(chóng)抑菌活性，但其作用的主要活性成分多為萜類(lèi)成分，如黃花蒿的有效成分主要為青蒿素及其類(lèi)似物等倍半萜成分[17-18]，而白沙蒿的活性成分主要為黃酮類(lèi)化合物和不飽和脂肪酸[9,19-20]，化學(xué)結(jié)構(gòu)類(lèi)型差異較大，這可能與其生存環(huán)境光照輻射強(qiáng)度大、晝夜溫差大等極端條件有關(guān)。

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，朱砂葉螨和斜紋夜蛾是較為常見(jiàn)的雜食性害蟲(chóng)，分布面積廣，危害寄主廣泛，危害性大，卻難于防治[21]。害螨和斜紋夜蛾的危害以南方為重，但在北方的夏季也頻有發(fā)生，危害著農(nóng)作物和牧草的種植。本研究選取了在全國(guó)大面積種植的豆科牧草苜蓿[22]和紅三葉，經(jīng)濟(jì)作物油菜和冷季型草坪草早熟禾，希望能對(duì)該植物提取物的使用提供理論依據(jù)。目前，在生產(chǎn)實(shí)踐中，常用的殺蟲(chóng)劑和殺螨劑多為合成類(lèi)化學(xué)農(nóng)藥，效果較為明顯，但也帶了諸多環(huán)境和食品安全問(wèn)題。本研究表明，白沙蒿在較低濃度下具有對(duì)朱砂葉螨顯著的觸殺活性，略高于同屬植物黃花蒿(A.annua)(LC50為0.434 1～1.381 7 mg·mL-1)[16-17]，一般認(rèn)為，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和除草劑在使用中必須注意最高施用濃度[23-24]，避免對(duì)作物和牧草的藥害，然而相對(duì)而言，殺蟲(chóng)劑的藥害概率要小，因而其藥害及給生產(chǎn)和環(huán)境帶來(lái)的副作用評(píng)價(jià)往往被忽略[25]。本研究為了提高白沙蒿提取物的利用度和可施用范圍，開(kāi)展了其對(duì)幾種作物和牧草的抑制活性試驗(yàn)。植物毒檢測(cè)結(jié)果顯示，白沙蒿提取物對(duì)受體植物油菜和牧草苜蓿、紅三葉和早熟禾的種植是安全的，不會(huì)造成藥害，容易降解，對(duì)施用環(huán)境是安全的。這與植物源農(nóng)藥環(huán)境友好的特點(diǎn)相一致。這些結(jié)果將為有機(jī)農(nóng)業(yè)和高質(zhì)量的栽培草地建植管理提供新思路。

圖3 白沙蒿提取物的植物毒活性Fig. 3 Phytotoxic activities of the extract obtained from Artemisia sphaerocephala

此外，白沙蒿提取物還對(duì)病原真菌具有明顯的抑制活性[12]。白沙蒿亦可入藥，對(duì)人體健康有諸多益處，有消炎散腫的功能，治療腮腺炎、扁桃體炎、瘡癤紅腫等病癥[26]；白沙蒿提取物，特別是其多糖和脂肪酸成分，常被開(kāi)發(fā)為保健食品或作為食品添加材料，對(duì)人體抗衰老和降糖保肝等有較好的療效[27-30]。

雖然目前白沙蒿的活性低于合成農(nóng)藥，但其具有植物源農(nóng)藥很多無(wú)可比擬的先天優(yōu)勢(shì)，而且可以通過(guò)進(jìn)一步開(kāi)展活性成分的研究工作，提升白沙蒿的殺蟲(chóng)、殺螨藥效。將白沙蒿開(kāi)發(fā)為預(yù)防病蟲(chóng)害的植物源農(nóng)藥，不僅防蟲(chóng)、殺蟲(chóng)、抗菌，對(duì)作物無(wú)害，作用時(shí)間長(zhǎng)，資源豐富，廉價(jià)易得，而且對(duì)食品和環(huán)境安全，具有巨大的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用潛力。

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