羅曉星

(解放軍第458醫(yī)院，廣東 廣州 510062)

急性心肌梗死(AMI)發(fā)生后，由于心室肌在缺血、缺氧等損害因素的持續(xù)作用下，導(dǎo)致左心室形態(tài)和大小的改變稱為左室重構(gòu)(LVR)。LVR的發(fā)生不僅導(dǎo)致AMI患者的心臟功能嚴(yán)重受損，還直接影響預(yù)后。因此，能夠早期發(fā)現(xiàn)、預(yù)測AMI患者發(fā)生LVR，對于及時治療或延緩LVR的發(fā)生、改善AMI患者預(yù)后具有非常重要的意義[1]。MicroRNA(miRNA)是廣泛存在于真核生物細胞中的一類內(nèi)源性的、非編碼的單鏈小分子RNA，具有調(diào)控多個上游基因表達和下游蛋白翻譯的能力[2]，因而在多種生理病理過程起著非常重要的作用。miR-208是在心肌組織中特異性表達的miRNA，其與心臟的發(fā)育等生理病理過程密切相關(guān)[3-4]。大規(guī)模、多中心臨床實驗發(fā)現(xiàn)miR-208是影響AMI患者心源性死亡和心臟衰竭的獨立危險因素[5-6]。目前對miR-208a與AMI后LVR相關(guān)性以及相關(guān)機制的研究較少，臨床上用于診斷AMI患者發(fā)生LVR的血清學(xué)指標(biāo)尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。本研究通過檢測AMI患者血清miR-208a水平，研究其與AMI患者發(fā)生LVR的相關(guān)性，初步探討血清miR-208a對AMI患者近期發(fā)生LVR的預(yù)測價值。

1 臨床資料

1.1一般資料 選擇2013年1月—2015年1月我院心血管內(nèi)科和干部病房診治的明確診斷為AMI患者60例，其中男48例，女12例；年齡(47.9±6.5)歲。均符合中華醫(yī)學(xué)會心血管病分會制定的AMI診斷標(biāo)準(zhǔn)，首次發(fā)作，在發(fā)病后24 h內(nèi)入院；患者及其家屬明確知曉且簽署知情同意書，且經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。排除其他各種原因?qū)е碌姆茿MI性心臟疾病者；合并腦、肺、肝、腎嚴(yán)重疾病者；合并晚期惡性腫瘤者；嚴(yán)重急慢性感染性疾病者；意識或精神原因不能配合者。另選擇同期30例健康體檢者作為健康對照組，男22例，女8例；年齡(45.3±5.9)歲，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1超聲數(shù)據(jù)檢測采集 分別于入院時及發(fā)病后6個月采用PHILIPS IE33彩色多普勒超聲診斷儀進行超聲數(shù)據(jù)檢測采集。受檢者左側(cè)臥位，在二維圖像下獲得心臟左室胸骨旁長軸在二尖瓣腱索水平的M型圖像，于呼氣末期測出舒張末期(QRS波起點)左室舒張末內(nèi)徑(EDD)、左室后壁厚度(LVPWT)和室間隔厚度(IVST)，測量5個心動周期取平均值。根據(jù)Devereux公式[7]計算左室質(zhì)量(LVM)和左室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)，根據(jù)發(fā)病6個月后LVMI將AMI患者分為左室重構(gòu)組34例和非左室重構(gòu)組26例。LVM=1.04×[(EDD+IVST+LVPWT)3-EDD3]-13.6(g)；LVMI=LVM/BSA(體表面積)(g/m2)。BSA=[0.006×身高(cm)+0.012 8×體質(zhì)量(kg)]-0.152 9。LVR診斷標(biāo)準(zhǔn)：LVMI≥125 g/m2(男性)或≥120 g/m2(女性)。

1.2.2血清樣本采集 采集AMI患者發(fā)病后24 h內(nèi)外周靜脈血5 mL，健康對照組取空腹外周靜脈血5 mL，室溫下靜置1 h，置于4 ℃，3 000 r/min離心15 min，取上層血清，集中統(tǒng)一編號后置于-80 ℃冰箱待測。

1.2.3實時熒光定量PCR ①血清總RNA提?。翰捎肨rizol試劑對血清總RNA進行提取。經(jīng)過RNA分相、沉淀、洗滌、溶解后，RNA電泳檢測提取RNA分子的完整性，Nanodrop? ND-1000測定提取RNA的濃度。②逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)：按照miScript Reverse Transcription Kit操作步驟構(gòu)建10 μL反應(yīng)體系，即RNA 3 μL， 1×mirVana RT Primer 1 μL，Array script Enzyme Mix 0.4 μL，mirVana RT Buffer(5×)2 μL，加RNase-free water至總體積10 μL。反應(yīng)條件：37 ℃，15 min；42 ℃，50 min；85 ℃，5 min。③實時熒光定量PCR反應(yīng)：按照miRNA SYBR Green PCR Kit 操作步驟構(gòu)建20 μL反應(yīng)體系，即5×Golden HS SYBR Green qPCR Mix 4 μL， PCR Forward Primer(20×) 1 μL，PCR Reverse Primer(20×) 1 μL，1×cDNA模板1～2.5 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，加入ddH2O至總體積20 μL。 反應(yīng)條件：95 ℃ 15 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個PCR循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后分析PCR反應(yīng)曲線，根據(jù)實時熒光定量PCR得出miRNA-208a與U6從基線到指數(shù)增長的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)(CT值)，采用2-ΔΔCT法對miR-21表達相對值進行分析。miR-208a正向引物序列：F-TGCGGTATAAGACGAGCAAA。

2 結(jié) 果

2.1AMI患者miR-208a表達水平 健康對照組人群血清miR-208a相對表達水平為0.177±0.034， AMI患者發(fā)病后24 h內(nèi)血清miR-208a相對表達水平為1.405±0.295，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。左室重構(gòu)組患者AMI發(fā)病后24 h內(nèi)血清miR-208a相對表達水平為1.728±0.314，而非左室重構(gòu)組患者AMI發(fā)病后24 h內(nèi)血清miR-208a相對表達水平為1.086±0.289，2組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2miR-208a表達水平與LVR相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，miR-208a水平與LVMI間呈正相關(guān)(r=0.539，P<0.05)。見圖1。

圖1 血清miR-208a表達水平與左室重構(gòu)程度相關(guān)性

2.3血清miR-208a表達水平對LVR的預(yù)測價值以AMI患者的LVMI為因變量，血清miR-208a表達水平作為自變量進行線性回歸分析。結(jié)果顯示血清miR-208a表達水平與LVR具有相關(guān)性(B=0.205，OR=0.930，P=0.01)，血清miR-208a表達水平越高，AMI患者發(fā)生LVR的可能性越大。

2.4血清miR-208a表達水平對LVR的診斷效能ROC曲線分析結(jié)果顯示，miR-208a曲線下面積(AUC)為0.73(P<0.001)；取相對表達值1.704為截斷點，血清miR-208a預(yù)測AMI患者發(fā)生LVR的靈敏度為82.64%，特異度為77.42%。見圖2。

3 討 論

AMI后患者發(fā)生LVR的具體機制十分復(fù)雜，已知與心肌細胞的凋亡、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)激活、免疫系統(tǒng)活化、細胞因子釋放、相關(guān)信號通路激活和基因的異常表達等有關(guān)，目前尚未完全明確。據(jù)多個臨床研究中心長期隨訪研究發(fā)現(xiàn)，LVR能夠較為敏感地反映AMI發(fā)生后患者心功能情況，也是影響AMI患者遠期發(fā)生心源性死亡的重要危險因素[8-9]。目前國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界針對預(yù)測AMI后患者發(fā)生LVR的獨立和敏感地血清標(biāo)志物已開展了大量的研究，也取得了一定的成果。Dominguez等[10]對一組161例AMI患者進行前瞻性調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，AMI后發(fā)生LVR患者血清中褪黑素水平明顯低于未發(fā)生LVR的患者。多元分析提示血清褪黑素水平是預(yù)測AMI后患者發(fā)生LVR的獨立預(yù)測因子。Fertin等[11]通過對246例AMI研究發(fā)現(xiàn)，AMI患者血清MMP-8水平與左心室舒張末期容積(LVEDV)呈明顯正相關(guān)；進一步單因素和多因素分析顯示，血清MMP-8水平是AMI后發(fā)生LVR的獨立預(yù)測指標(biāo)。郭潮等[12]研究發(fā)現(xiàn)，AMI患者血清生長分化因子-15(GDF-15)水平與LVMI呈明顯正相關(guān)，而與射血分?jǐn)?shù)、相對室壁厚度呈明顯負(fù)相關(guān)；提示血清GDF-15水平能反映AMI患者LVR程度。雖然已經(jīng)有多個能夠反映AMI后發(fā)生LVR的標(biāo)志物，但這些標(biāo)志物對LVR的預(yù)測價值存在一定的局限性。因此，如何針對AMI后患者發(fā)生LVR的相關(guān)機制進行深入研究，以及針對機制尋找能夠較早的預(yù)測LVR的獨立標(biāo)志物和開發(fā)特效新藥，仍然是目前臨床醫(yī)學(xué)界研究的重點。

圖2 血清miR-208a的ROC曲線

miRNA是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性非編碼的短鏈小RNA分子，其主要通過與目標(biāo)mRNA 3’端非編碼區(qū)相互補匹配(完全互補或者幾乎完全互補)，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控目標(biāo)基因。研究證實miRNA具有調(diào)控多個靶點基因的能力，其在機體的多種生理病理過程起著非常重要的調(diào)控作用[13]。由于miRNA在組織循環(huán)中相對穩(wěn)定又具有生物遺傳和種屬表達保守性的特點，因此，醫(yī)學(xué)上針對miRNA開展了一系列疾病監(jiān)測和靶向治療研究。

miR-208a為在心肌組織中特異性表達的miRNA。生理情況下，miR-208a在心肌干細胞的分化、心肌細胞肌球蛋白含量、肌纖維的成分及心肌細胞收縮性能上起著重要的調(diào)控作用[3]。病理情況下，心肌細胞中miR-208a的表達失調(diào)則與心肌膠原的堆積、心肌重構(gòu)、心肌肥大、心律失常等心臟損傷過程密切相關(guān)[14-15]。且由于miR-208a具有高度組織特異性，目前很多研究認(rèn)為心肌組織中異常高表達的miR-208a是一個強有力的預(yù)測心臟衰竭和心源性死亡的分子指標(biāo)[16]。

本研究顯示，AMI患者血清miR-208a表達水平顯著高于健康對照組，這與國內(nèi)外相關(guān)研究數(shù)據(jù)是一致的[17]。左室重構(gòu)患者血清miR-208a表達水平顯著高于非左室重構(gòu)患者。Pearson相關(guān)分析顯示，血清miR-208a水平與LVMI間呈顯著正相關(guān)。線性回歸分析顯示血清miR-208a水平與LVR具有獨立相關(guān)性。以上研究結(jié)果提示血清miR-208a表達水平越高，AMI患者發(fā)生LVR的可能性也越大，即高表達的血清miR-208a 是AMI患者發(fā)生LVR 的獨立預(yù)測因子。

為研究miR-208a對AMI后患者發(fā)生LVR的診斷效能，本研究以反映左室重構(gòu)程度的LVMI為因變量，對血清miR-208a水平進行ROC曲線分析。ROC曲線是反映敏感性和特異性連續(xù)變量的綜合指標(biāo)，其曲線下面積越大診斷準(zhǔn)確性越高。結(jié)果顯示，miR-208a曲線下面積為0.73(P<0.001)；取相對表達值1.704為截斷點，血清miR-208a預(yù)測AMI患者發(fā)生LVR的靈敏度為82.64%，特異度為77.42%?？梢娧錷iR-208a對AMI后發(fā)生LVR具有較高的診斷價值。

綜上可見，血清miR-208a與AMI后LVR的發(fā)生具有相關(guān)性，具有作為預(yù)測AMI后發(fā)生LVR的分子標(biāo)志物的條件。但需進一步進行大樣本及延長隨訪時間來進行驗證研究。此外，尚需要更多的基礎(chǔ)及臨床試驗進一步驗證及闡明其相關(guān)機制。

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