衛(wèi) 娜，王曉曉，王映棋，李 寧，程 羽，田守征，袁嘉麗

(云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500)

近年來(lái)，由于霧霾等大氣污染越來(lái)越嚴(yán)重，呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率逐年上升，預(yù)計(jì)到2020年慢性阻塞性肺疾病(COPD)將上升至全球致死病因第三位、疾病經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)第五位[1]。氣道炎癥和氣道重塑是COPD的基本病理特征之一，氣道炎癥既是COPD發(fā)病的主要原因，同時(shí)也是造成氣流受限和氣道重塑的重要原因。COPD氣道炎癥反應(yīng)過(guò)程中的炎癥細(xì)胞、炎癥遞質(zhì)、氣道的定植菌、氣道局部黏膜免疫分子、受損的細(xì)胞器以及細(xì)胞代謝產(chǎn)物等構(gòu)成了氣道炎癥微環(huán)境。當(dāng)病原微生物等進(jìn)入機(jī)體時(shí)，會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的防御反應(yīng)，招募并活化多種炎癥細(xì)胞和炎癥遞質(zhì)聚集在氣道局部[2]，氣道局部微環(huán)境平衡被打破，當(dāng)機(jī)體這種防御反應(yīng)不能消除病原微生物時(shí)，就會(huì)發(fā)展成慢性氣道炎癥[3]，進(jìn)一步損傷氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞，導(dǎo)致氣道壁損傷和修復(fù)反復(fù)進(jìn)行，最終形成氣道重塑?？梢?jiàn)，氣道局部微環(huán)境失衡對(duì)于COPD的發(fā)生發(fā)展有著重要影響。玉屏風(fēng)散加味方是云南省名中醫(yī)李慶生教授的臨床驗(yàn)方，該方緊扣COPD本虛標(biāo)實(shí)的基本病機(jī)而選方用藥，對(duì)于氣道重塑相關(guān)因子MMP-9、TIMP-1、TGF-β1均有調(diào)節(jié)作用[4]。本研究進(jìn)一步探討了玉屏風(fēng)散加味方對(duì)氣道炎癥微環(huán)境中分泌型免疫球蛋白A(SIgA)、多聚免疫球蛋白受體分泌片(SC)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)的影響，旨在為該方治療COPD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性Wistar大鼠36只，體質(zhì)量180～220 g，由四川省達(dá)碩生物研究所提供，合格證號(hào)：0018491；許可證號(hào)：SCXK(川)2013-24。

1.2試劑及儀器 脂多糖(LPS，美國(guó)Simga公司生產(chǎn)，規(guī)格：10 mg/支)，紅塔山牌香煙[84 mm烤煙型香煙，紅塔煙草(集團(tuán))有限責(zé)任公司]，大鼠SIgA、SC、TNF-α、IL-8酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司)。自制有機(jī)玻璃煙熏箱(50 cm×40 cm×30 cm)，電熱恒溫干燥箱(湖北省黃石市醫(yī)療器械廠)，YP型電子天平(上海光正醫(yī)療器械有限公司)，F(xiàn)A1204C型電子天平(常州科源電子儀器有限公司)，石蠟切片機(jī)(Leica RM2245，德國(guó)徠卡)，攤片機(jī)(Leica HI1210, 德國(guó)徠卡)，烘片機(jī)(Leica HI1220，德國(guó)徠卡)，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(H1850R，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)，顯微鏡(Cl/Ds-Fi型，日本尼康)。

1.3藥物及制備 玉屏風(fēng)散加味方：黃芪30 g、白術(shù)20 g、防風(fēng)10 g、桑白皮15 g、浙貝母15 g、白芥子15 g、三七9 g、莪術(shù)15 g。根據(jù)生藥與浸膏的比值，按照成人臨床服藥濃度換算為大鼠給藥濃度，每只大鼠每日需給全方生藥量17.2 g/kg為高劑量，低、中、高劑量比按1∶2∶4計(jì)算[5]。羅紅霉素膠囊(江蘇聯(lián)環(huán)藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：20150802)成人臨床一日服藥量為300 mg，根據(jù)中藥給藥方法計(jì)算出每只大鼠每日所需給藥量為0.04 g/kg，給藥前用0.9%氯化鈉溶液制備成混懸液。

1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、造模及干預(yù) 將上述大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、羅紅霉素組、玉屏風(fēng)散加味方低劑量組、玉屏風(fēng)散加味方中劑量組、玉屏風(fēng)散加味方高劑量組，每組6只。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前先適應(yīng)性觀察1周。正常組于第1，14天在10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉下氣管內(nèi)注入生理鹽水200 μL，其余時(shí)間正常飼養(yǎng)。其余組參照文獻(xiàn)[6]方法采用大鼠氣管內(nèi)注入LPS和持續(xù)被動(dòng)煙熏刺激的方法復(fù)制COPD大鼠模型，即分別于第1，14天在10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉下氣管內(nèi)注入脂多糖200 μL,第2—13天和第15—56天上午將大鼠置入自制密閉有機(jī)玻璃箱內(nèi)進(jìn)行香煙煙熏，30 min/d。實(shí)驗(yàn)造模周期共8周，模型成功后給予大鼠繼續(xù)隔天煙熏刺激8周，實(shí)驗(yàn)第17周開(kāi)始各給藥組給予相應(yīng)劑量藥物灌胃，正常組和模型組給予生理鹽水灌胃，共灌胃28 d。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法 末次灌胃24 h后處死各組大鼠，取大鼠一側(cè)肺組織做病理切片，蘇木素-伊紅(HE)染色觀察肺組織病理學(xué)變化。取大鼠另一側(cè)肺組織400 mg用冰冷的生理鹽水沖洗去除血液，濾紙拭干，在研磨缽中倒入液氮預(yù)冷，將拭干后的肺組織放入研磨缽中，加入液氮，研磨。將研碎的肺組織倒入EP管中，加入1 mL磷酸緩沖鹽溶液(pH 7.4)，用低溫離心機(jī)(3 000 r/min)離心20 min，取上清液，用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)大鼠肺組織勻漿中SIgA、SC、TNF-α、IL-8的表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠肺組織病理切片表現(xiàn) 正常組大鼠肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，支氣管上皮完整，纖毛結(jié)構(gòu)完整、排列整齊，氣管、血管周圍無(wú)明顯炎癥反應(yīng)，肺泡結(jié)構(gòu)正常，腔內(nèi)無(wú)明顯滲出物，見(jiàn)圖1。模型組大鼠氣管上皮脫落、充血，可見(jiàn)肺大泡，肺內(nèi)細(xì)支氣管上皮增生、管腔變窄、管壁增厚，管壁及肺間質(zhì)周圍可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖2。羅紅霉素組大鼠肺內(nèi)細(xì)支氣管周圍炎性細(xì)胞較模型組減少，肺泡間隔增寬，見(jiàn)圖3。玉屏風(fēng)散加味方各組大鼠肺內(nèi)細(xì)支氣管上皮增生不明顯，管壁及肺間質(zhì)周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯，可見(jiàn)肺大泡，細(xì)支氣管管腔狹窄及間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等情況較模型組明顯改善，且高劑量組改善更明顯，見(jiàn)圖4～6。

圖1 正常組大鼠肺組織病理切片表現(xiàn)(10×10)

圖2 模型組大鼠肺組織病理切片表現(xiàn)(10×10)

圖3 羅紅霉素組大鼠肺組織病理切片表現(xiàn)(10×10)

2.2各組大鼠肺組織中SIgA、SC、TNF-α、IL-8表達(dá)水平 模型組大鼠肺組織中SIgA、IL-8 SC表達(dá)水平與正常組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>>0.05)，TNF-α表達(dá)水平明顯高于正常組(P<0.05)。玉屏風(fēng)散加味方低劑量組SIgA表達(dá)水平和玉屏風(fēng)散加味方中、低劑量組SC表達(dá)水平均明顯高于模型組(P均<0.05)，玉屏風(fēng)散加味方高、低劑量組TNF-α表達(dá)水平明顯低于模型組(P均<0.05)；玉屏風(fēng)散加味方高、中劑量組SIgA表達(dá)水平和玉屏風(fēng)散加味方高劑量組SC表達(dá)水平、玉屏風(fēng)散加味方中劑量組TNF-α表達(dá)水平、玉屏風(fēng)散加味方各劑量組IL-8表達(dá)水平與模型組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

圖4 玉屏風(fēng)散加味方高劑量組大鼠肺組織病理切片表現(xiàn)(10×10)

圖5 玉屏風(fēng)散加味方中劑量組大鼠肺組織病理切片表現(xiàn)(10×10)

圖6 玉屏風(fēng)散加味方低劑量組大鼠肺組織病理切片表現(xiàn)(10×10)

3 討 論

表1 各組大鼠肺組織中SIgA、SC、TNF-α、IL-8表達(dá)水平比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

COPD屬于中醫(yī)“咳嗽”“肺脹”“喘證”等范疇[7]，基本病機(jī)是本虛標(biāo)實(shí)，肺氣虛是該病的始發(fā)和根本原因[8]，痰濁、血瘀、水飲互結(jié)為標(biāo)。COPD氣道炎癥反應(yīng)實(shí)質(zhì)上是氣道局部微環(huán)境失衡的一種表現(xiàn)。李慶生教授提出“中醫(yī)邪正發(fā)病學(xué)說(shuō)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的免疫及微生態(tài)平衡觀具有一致性”，并且認(rèn)為正常的免疫功能及微生態(tài)平衡屬于“正氣”范疇，微生態(tài)失調(diào)與免疫功能低下或紊亂屬于“邪氣”范疇，因而在治療疾病時(shí)應(yīng)注重調(diào)整失調(diào)狀態(tài)，補(bǔ)其不足、瀉其有余，恢復(fù)機(jī)體內(nèi)部及與外環(huán)境的相對(duì)平衡協(xié)調(diào)[9-11]。玉屏風(fēng)散加味方以“益氣扶正”經(jīng)典方藥玉屏風(fēng)散為基礎(chǔ)，配伍滌痰散結(jié)之桑白皮、浙貝母、白芥子，逐瘀散結(jié)之三七、莪術(shù)，通過(guò)“益氣扶正祛邪”調(diào)節(jié)氣道炎癥微環(huán)境，恢復(fù)局部微環(huán)境平衡，從而減輕氣道炎癥反應(yīng)，延緩氣道重塑的發(fā)展。

呼吸道黏膜免疫系統(tǒng)作為黏膜免疫系統(tǒng)的重要組成部分，是保護(hù)呼吸道對(duì)抗外來(lái)有害物質(zhì)侵襲的第一層防護(hù)墻。SIgA是呼吸道黏膜分泌的主要抗體，由J鏈連接2個(gè)單體IgA和分泌片SC組成，能保護(hù)黏膜防止細(xì)菌和病毒等黏附在黏膜表面，而被pIgR轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的IgA可以中和病毒的復(fù)制[12]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)呼吸道黏膜中分泌的SIgA水平降低時(shí)，機(jī)體患上呼吸道感染的概率較大，SIgA水平與機(jī)體對(duì)抗上呼吸道感染的能力有直接關(guān)系[13]。IL-8是一種炎性遞質(zhì)，能激活并趨化中性粒細(xì)胞，促使其脫顆粒和釋放彈性蛋白酶等物質(zhì)損傷氣道[14]，目前在COPD急性期和穩(wěn)定期患者的血清中均發(fā)現(xiàn)IL-8表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組[15-16]，提示IL-8參與COPD發(fā)生發(fā)展。TNF-α是一種主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的促炎因子，除了能激活白細(xì)胞啟動(dòng)炎癥反應(yīng)外，還能通過(guò)誘導(dǎo)氣道黏液細(xì)胞的化生和高分泌、氣道上皮細(xì)胞TNF-α和IL-8等受體的表達(dá)，從而參與上皮細(xì)胞的損傷和肺氣腫；并且TNF-α還可以誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞等生成IL-8，進(jìn)一步加劇氣道炎癥[17]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，玉屏風(fēng)散加味方各組大鼠肺組織病理情況較模型組有明顯改善，且高劑量組改善效果更明顯；模型組大鼠SIgA表達(dá)水平有低于正常組的趨勢(shì)(無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異可能是由于樣本量較小所致)，這與張繼華等[18]的研究結(jié)果相符；模型組大鼠IL-8表達(dá)水平有低于正常組的趨勢(shì)，筆者推測(cè)或許是在復(fù)制大鼠模型時(shí)刺激了IL-8上游或是下游的某些機(jī)制而造成的，具體原因有待探索；模型組SC表達(dá)水平有高于正常組的趨勢(shì)，筆者推測(cè)其原因可能是受TNF-ɑ表達(dá)水平升高所影響。有研究顯示，TNF-α可通過(guò)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子IRF-1的合成而影響pIgR的表達(dá)，當(dāng)TNF-ɑ濃度增高時(shí)，pIgR mRNA的表達(dá)水平隨之升高[19]，具體原因有待后期進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探索。玉屏風(fēng)散加味方低劑量組SIgA表達(dá)水平和玉屏風(fēng)散加味方中、低劑量組SC表達(dá)水平均明顯高于模型組，玉屏風(fēng)散加味方高、低劑量組TNF-α表達(dá)水平明顯低于模型組，玉屏風(fēng)散加味方高、中劑量組SIgA表達(dá)水平和玉屏風(fēng)散加味方高劑量組SC表達(dá)水平、玉屏風(fēng)散加味方中劑量組TNF-α表達(dá)水平、玉屏風(fēng)散加味方各劑量組IL-8表達(dá)水平與模型組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示玉屏風(fēng)散加味方可以增強(qiáng)或恢復(fù)機(jī)體正常免疫防御功能，從而減輕氣道炎癥。

綜上所述，玉屏風(fēng)散加味方可改善COPD模型大鼠肺組織病理形態(tài)，增強(qiáng)SIgA和SC的表達(dá)，降低TNF-α和IL-8的表達(dá)，提示該方藥可干預(yù)COPD氣道炎癥微環(huán)境，增強(qiáng)機(jī)體局部黏膜免疫功能，減輕炎癥反應(yīng)。

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