曹尚美，黃雯靜，王立范

1.漯河市中心醫(yī)院，河南 漯河 462000 2.山東省萊蕪市中醫(yī)醫(yī)院，山東 萊蕪 271100 3.黑龍江省中醫(yī)藥科學院，黑龍江 哈爾濱 150036

蛋白尿是評估腎功能損害的一個最常用的指標，也是反應慢性腎臟病進展的重要標志物，腎小球過濾屏障的完整性取決于其3層結構(內皮、腎小球基底膜和足細胞)，腎小球高灌注、高濾過和腎小球濾過屏障的損壞都會導致蛋白尿[1]。足細胞在腎小球濾過屏障中是最后一道屏障，裂孔隔膜(SD)是腎小球足細胞-腎小球濾過屏障的主要部分，而電荷屏障被認為是定位于腎小球基底膜。研究顯示腎小球疾病與Nephrin mRNA的減少有關，Nephrin mRNA水平可以作為反應腎小球疾病進展的標志[2]。有研究顯示在阿霉素(ADR)誘導的腎病中，足細胞的損傷直接導致蛋白尿的產生，其作用機制可能與Nephrin蛋白的表達下調相關[3]。腎小球疾病的發(fā)病機制非常復雜，包括炎性細胞的浸潤，腎小球細胞增殖，以及足細胞相關分子(如Nephrin或Podocin)的功能障礙[1]。

腎炎消白顆粒(SYXB顆粒)是根據張琪教授多年臨床經驗方研制而成，主要由土茯苓50 g，黃芪40 g，黨參、山藥、生薏苡仁、桑椹子、金櫻子、菟絲子、牛膝各20 g，沙參、玄參各15 g，白茅根、白花蛇舌草各30 g，甘草10 g組成，對治療腎小球腎炎蛋白尿有很好的療效。本實驗根據文獻報道[4]采用一次性尾靜脈注射ADR制備腎病蛋白尿模型。阿霉素腎病動物模型具有病變穩(wěn)定，用藥后3 h～56天腎組織可見明顯超微結構改變；且蛋白尿持續(xù)時間長，可持續(xù)9個月以上；該模型還具有慢性進展性腎損害的特點，與人類進行性腎病表現(xiàn)類似，是研究蛋白尿與慢性腎臟疾病進展的最佳動物模型。本研究通過觀察SYXB顆粒對阿霉素大鼠腎臟組織中Nephrin蛋白表達的影響，探討其作用機理。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 100只雄性Wistar大鼠購于北京維通利華實驗技術有限公司，體質量180～200 g，生產許可證編號：SCXK(京2012-0001)，合格證號：No.11400700008581。動物實驗通過動物倫理委員會的審批。動物實驗在哈爾濱醫(yī)科大學附屬二院SPF級動物實驗室進行，合格證號：SCXK(黑)2013-001，實驗室的溫度控制在(20±3)℃，濕度控制在60%左右。

1.2 實驗藥物 腎炎消白顆粒(黑龍江省中醫(yī)醫(yī)院藥廠)規(guī)格：10 g，黑藥制字 Z20090011，批號：130302。洛汀新(上海新亞藥業(yè)閔行有限公司)規(guī)格：10 mg，國藥準字H20044840，批號：120402。阿霉素(浙江海正藥業(yè)公司)規(guī)格：10 mg，國藥準字H33021980，批號：111201。

1.3 試劑和設備 DAB顯色試劑盒：北京中杉金橋生物技術有限公司。PV-600(兔抗鼠二抗)：北京中杉金橋生物技術有限公司。EDTA抗原修復液：北京中杉金橋生物技術有限公司。Nephrin兔抗大鼠多克隆抗體：北京博奧森生物技術有限公司。病理切片機：美國Thermo HM340E，顯微鏡及攝像系統(tǒng)：日本OLYMPUS，數碼病理圖像分析系統(tǒng)MoticMed 6.0，尿白蛋白是由自動蛋白分析儀(SIEMENS BNTMII)進行檢測，尿肌酐是由全自動生化分析儀(SIEMENS ADVIA2400)進行檢測。

1.4 模型制備及分組 大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，放置在室溫(22±1)℃的空調室內，12 h照明，不間斷給予自來水及含有18%蛋白質的標準大鼠飼料。100只Wistar雄性大鼠隨機分為空白組(20只)和造模組(80只)，造模組一次性尾靜脈注射ADR 6.5 mg/kg。3天后，用蛋白試紙測試大鼠尿液，空白組大鼠尿蛋白試紙條為黃色，證明蛋白尿為陰性，造模組大鼠尿蛋白試紙條為綠色或者橙色，證明蛋白尿為陽性，造模組大鼠又隨機分為模型組、洛汀新組、中藥低劑量組、中藥高劑量組，每組20只。

1.5 給藥方法 空白組、模型組灌胃蒸餾水2 mL/d，洛汀新組灌胃洛汀新0.90 mg/kg，中藥高、低劑量組分別灌胃SYXB顆粒3.60、1.80 g/kg，每天1次，1周連續(xù)給藥6次，共給藥7周。

1.6 標本的采集 每周第7天清晨用代謝籠收集隨機尿液，檢測尿蛋白排泄量。第3、5周末各組分別選取3只大鼠處死取右腎，用4%多聚甲醛固定，以備免疫組化檢測及光鏡下對腎臟進行組織學檢查。7周末大鼠處死后，取大鼠右腎，立即投入4%多聚甲醛中固定，以備免疫組化檢測及光鏡下對腎臟進行組織學檢查。鏡下觀察以胞質或胞膜出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性反應，每張切片于皮質處隨機選取5個視野，采用MoticMed 6.0病理圖像分析軟件，計算每個腎小球陽性信號平均面密度(細胞陽性表達面積與視野總面積百分比)。

1.7 免疫組化檢測 ①石蠟包埋組織，制成4μm切片。②常規(guī)脫蠟失水。③將切片浸入EDTA抗原修復液(pH 8.0)中，微波爐中高溫加熱至沸騰后斷電，間隔10 min，反復2次。④放入3%H2O2去離子水孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶。⑤滴加按比例稀釋的一抗(Nephrin兔抗大鼠多克隆抗體)，置入4℃冰箱過夜。陰性對照用PBS代替一抗滴加。⑥滴加生物素標記的二抗，37℃孵育30 min。陰性對照用PBS代替二抗滴加。⑦選用DAB顯色5～10 min，自來水充分沖洗。

1.8 病理切片觀察 4%多聚甲醛固定腎臟，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，制成3 μm石蠟切片，按常規(guī)方法行HE染色，觀察光鏡下腎組織病理學改變。

1.9 統(tǒng)計學方法 用SPSS19.0軟件進行數據分析，計量資料以(±s)表示，兩兩比較用q檢驗，各組及時間點比較用方差分析。

2 結果

2.1 一般情況 注射完阿霉素之后的大鼠，逐漸出現(xiàn)懶動、嗜睡，甚至牙齒掉落、毛發(fā)脫落等現(xiàn)象，毛發(fā)跟空白組相比沒有光澤，后期伴有嚴重的腹水和消瘦。用SYXB顆粒治療7周后，癥狀明顯輕于模型組，與洛汀新組比較，中藥高劑量組狀態(tài)較好。

2.2 各組大鼠尿蛋白/肌酐比值比較 見表1。與空白組比較，模型組大鼠各時間點尿白蛋白/尿肌酐比值顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。與模型組比較，洛汀新組大鼠各時間點尿白蛋白/尿肌酐比值顯著降低，中藥高劑量組大鼠在第3、4、5、6、7周尿白蛋白/尿肌酐比值顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與洛汀新組比較，中藥高劑量組大鼠在第5、6、7周尿白蛋白/尿肌酐比值較低，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.3 各組大鼠腎組織Nephrin蛋白表達比較 見表2，圖1。各用藥組中，Nephrin蛋白在第3周末表達上調，第5周末開始下調，而到第7周后表達上調，Nephrin蛋白的表達經歷了一個先升后降再升的過程，最終在第7周末表達再次上調。與空白組比較，模型組大鼠各時間點腎組織Nephrin蛋白表達顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與模型組比較，洛汀新組、中藥高劑量組大鼠各時間點腎組織Nephrin蛋白表達顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與第3周末比較，洛汀新組、中藥高、低劑量組大鼠各時間點腎組織Nephrin蛋白表達顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

表1 各組大鼠尿白蛋白/尿肌酐比值比較(±s) mg/g

表1 各組大鼠尿白蛋白/尿肌酐比值比較(±s) mg/g

與空白組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.05；與洛汀新組比較，③P＜0.05

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表2 各組大鼠腎組織Nephrin蛋白表達比較(±s)

表2 各組大鼠腎組織Nephrin蛋白表達比較(±s)

與空白組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與第3周比較，③P＜0.05

組 別空白組模型組洛汀新組中藥高劑量組中藥低劑量組第3周0.0 2 0±0.0 0 1 0 0.0 1 0±0.0 0 1 2①0.0 1 3±0.0 0 2 0②0.0 1 8±0.0 0 3 0②0.0 1 1±0.0 0 3 4第5周0.0 2 0±0.0 0 1 8 0.0 0 9±0.0 0 1 6①0.0 1 2±0.0 0 3 0②③0.0 1 5±0.0 0 2 0②③0.0 0 9±0.0 0 2 0③第7周0.0 2 0±0.0 0 1 3 0.0 0 7±0.0 0 2 3①0.0 1 4±0.0 0 2 0②③0.0 2 0±0.0 0 2 0②③0.0 1 6±0.0 0 2 5③

圖1 各組大鼠腎臟組織中Nephrin表達結果 (×400)

2.4 各組大鼠7周內腎臟的病理學改變 見圖2。光鏡下對腎臟組織學的檢查中，模型組大鼠腎臟表現(xiàn)為纖維組織增生，間質充血，腎小球出血，炎性細胞浸潤，腎小管中出現(xiàn)蛋白管型、腎小管萎縮和腎小球萎縮、腫脹、變性的特征。第5周末，模型組大鼠出現(xiàn)節(jié)段硬化的情況，洛汀新組和中藥低劑量組大鼠仍然有間質充血、腎小球腫脹和炎性細胞浸潤的情況，中藥高劑量組大鼠腎小球內有少量出血，間質內有少量炎性細胞浸潤。第7周，模型組腎小球萎縮，伴有大量炎性細胞浸潤，洛汀新組大鼠腎小球內仍有節(jié)段性硬化，中藥高劑量組大鼠間質內有少量出血，中藥低劑量組大鼠腎小管周圍有纖維組織增生，腎小球內有蛋白管型，并伴有間質出血。

圖2 各組大鼠7周內腎臟的病理學改變 (×400)

3 討論

實驗后期觀察到模型組大鼠牙齒變黃濁，失去原有的光澤和透明度，甚至變脆易折斷?！夺t(yī)述》曰“腎主骨，齒者骨之余，髓之所養(yǎng)，足陽明之支者，入于上齒，手陽明之支者，入于下齒若骨髓不足，陽明脈虛，則齒之諸病生矣；陽明實則齒堅牢，陽明虛則齒浮動?！甭阅I小球腎炎蛋白尿以脾腎虛損為本，腎虛髓枯，脾胃不充，齒失所養(yǎng)，故出現(xiàn)齒豁。實驗后期中藥高劑量組大鼠牙齒完整，表面光亮透明，較其它治療組明顯，分析此作用可能與SYXB顆粒中補脾腎藥物有關，可通過補腎而使骨髓充養(yǎng)骨骼，補脾胃充實陽明而堅固齒齦，增強骨骼堅韌度。

慢性腎臟病是進展性疾病，不論病因如何，其腎組織結構改變常有一些共同點，基本形態(tài)學表現(xiàn)為毛細血管腔狹窄、閉塞缺血，腎小球玻璃樣變性、硬化萎縮、數目減少，基底膜增厚，系膜細胞增殖，腎小管內大量蛋白管型，腎小管增粗或萎縮，結締組織增生[5]。阿霉素腎病模型大鼠基本病理改變隨病程進展，先后表現(xiàn)類似于人類微小病變型腎病、局灶節(jié)段性腎小球硬化癥及腎小球硬化伴間質纖維化病變，實驗室檢查顯示持續(xù)大量蛋白尿、低蛋白血癥、高脂血癥等異常；大量蛋白尿已被證實是加重腎臟病理損傷的獨立危險因素，隨著大鼠蛋白尿的增多，腎臟病理改變逐漸加重[6]。

大量實驗證明蛋白尿跟足細胞的損傷相關，足細胞裂孔隔膜是濾過蛋白的關鍵結構，Nephrin是足細胞膜結構上的關鍵蛋白，對膜穩(wěn)定性起著主要的作用，足細胞的破壞跟此種基因的變化密切相關，足細胞損傷最先反應在足細胞因子的異常變化，有報道指出隨著蛋白尿的增多，足細胞損傷后，足細胞因子Nephrin會隨之變化，不同的時間點檢測，腎皮質中足細胞因子含量也不同[7～9]。光鏡下觀察，3周末模型組大鼠表現(xiàn)為纖維組織增生，間質充血，腎小球出血，炎性細胞浸潤，腎小管中出現(xiàn)蛋白管型、腎小管萎縮和腎小球萎縮、腫脹、變性的特征；第5周末，與第3周相比更加嚴重，模型組出現(xiàn)了腎小球局灶節(jié)段性硬化，光鏡下發(fā)現(xiàn)腎小球有新月體的形成。經過7周治療，中藥組大鼠病理改變有所好轉，以中藥高劑量組大鼠最明顯。由此可說明Nephrin蛋白的表達跟腎病的進展有著明確的聯(lián)系，SYXB顆粒能上調Nephrin蛋白的表達。相關的研究發(fā)現(xiàn)，第5周時，光鏡下顯示，大鼠腎臟發(fā)生了硬化，產生了器質性病變，損傷已經無法恢復，沒有正常數量的足細胞去表達基因，所以基因開始無法代償性增加，轉而下降[10]。也有研究顯示基因的變化跟蛋白尿增多、足細胞的損傷、裂孔隔膜的破壞關系密切，而剛開始的第3周，正是腎臟早期代償性增大的時間，已有報道顯示腎病早期腎臟為了應付損傷會用增大來代償損傷，所以增大的腎臟表達的Nephrin蛋白也會相應增多[11]。光鏡下觀察到，造模后的大鼠腎小球在第3周時出現(xiàn)腫脹變大，5周時模型組大鼠逐漸出現(xiàn)腎小球硬化和萎縮，第7周模型組大鼠情況仍然惡化，而各給藥組大鼠腎小球腫脹和萎縮情況改善，以中藥高劑量組改善最佳。所以第3周時Nephrin蛋白會增加，而第5周的時候蛋白表達下降，第7周給藥組蛋白表達上升。課題組認為SYXB顆粒和洛汀新治療后延遲了腎臟的這種損傷和硬化的程度，所以相比于模型組蛋白表達是略升高的，至于延遲這種損傷的機制，認為是SYXB顆粒和洛汀新減輕了大鼠的癥狀，提高了機體抗病的能力，保持了內環(huán)境的平衡，使得腎臟有更多的能量應付損傷，減慢了損傷的速度。

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