楊娜，劉豐林

開封市中醫(yī)院，河南 開封 475001

糖尿病的病因多種多樣，飲食不節(jié)、腎虛、情志失調(diào)均可導(dǎo)致發(fā)病，其病機(jī)核心以燥熱為害，燥熱耗損津液，水精代謝失調(diào)，氣血循環(huán)阻滯，痰濁內(nèi)生，體液暗耗而成消渴，基本病機(jī)是陰虛燥熱[1]。中醫(yī)藥防治糖尿病有著悠久的歷史，經(jīng)過幾千年的實(shí)踐，積累了大量寶貴的經(jīng)驗(yàn)，并逐漸形成了獨(dú)特的學(xué)術(shù)體系[2]。在前人治療糖尿病的基礎(chǔ)上，依據(jù)辨證論治的原則，總結(jié)開發(fā)出十一味益腎降糖方，該制劑由黃芪、生地黃、白術(shù)、山茱萸、益母草、山藥等中藥組成，具有益氣健脾、補(bǔ)腎降糖、利水消腫之功效，是開封市中醫(yī)院的院內(nèi)制劑，獲得河南省食品藥品監(jiān)督管理局制劑批文(豫藥制字Z04020164)，治療糖尿病、腎病具有較好療效[3]。本研究探討十一味益腎降糖方對(duì)2型糖尿病(NIDDM)大鼠的降血糖作用以及對(duì)腎臟Wnt/β-catenin信號(hào)通路表達(dá)的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自北京維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0016。在河南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心溫度為(23±2)℃、濕度為(50±10)%、12 h光照交替的環(huán)境中飼養(yǎng)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過動(dòng)物倫理委員會(huì)的審批。

1.2 藥品與試劑 十一味益腎降糖方由本院藥劑科自制，濃縮成1.5 g生藥/mL水煎劑的濃度。達(dá)格列凈片(AstraZeneca公司)，鏈脲佐菌素(STZ，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，批號(hào)：B64927)；糖化血紅蛋白(HbA1c)測(cè)試盒(美國(guó) Roche 公司)；胰島素(FINS)酶聯(lián)免疫(ELISA)法測(cè)試盒(瑞典 Mercodia 公司)；Wnt/βcatenin抗體(美國(guó)Abcam公司)；檸檬酸、檸檬酸三鈉均購(gòu)自天津化學(xué)試劑有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 TBA-40FR(ACCUTE)全自動(dòng)生化分析儀(日本東芝公司)；Microcl17微量離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)；Heraeus Biofuge Stratos冷凍離心機(jī)(德國(guó)Heraeus公司)；Power Wave 340酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)Bio-TeR公司)；雅培安妥超越型血糖儀(美國(guó)Abbott公司)及安妥超越血糖試紙。

1.4 模型的建立、分組及干預(yù) 60只SD大鼠隨機(jī)均分為6組，即正常對(duì)照組、模型組、達(dá)格列凈組與十一味益腎降糖方低、中、高劑量組，每組10只。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，除正常對(duì)照組給予普通顆粒飼料外，其余5組大鼠給予高糖高脂飼料，喂養(yǎng)4周后，禁食12 h后腹腔注射STZ 50 mg/kg，1周后空腹血糖(FBG)≥11.1 mmol/L為模型復(fù)制成功[4]。達(dá)格列凈組每天灌胃達(dá)格列凈片1 mg/(kg·d)，十一味益腎降糖方低、中、高劑量組分別灌胃十一味益腎降糖方水煎液2、4、16 g/(kg·d)，正常對(duì)照組和模型組灌胃等量的生理鹽水，每天給藥1次，連續(xù)給藥7周。給藥期間正常對(duì)照組大鼠仍以普通顆粒飼料喂養(yǎng)，其余大鼠繼續(xù)以高糖高脂飼料喂養(yǎng)。

1.5 指標(biāo)的測(cè)定 分別于給藥前及給藥7周后，各組大鼠禁食12 h，取全血，4℃下3 000 r/min離心10 min，分離得血清和血漿，分別測(cè)定大鼠FBG水平、HbA1c水平和FINS水平，采用以下公式計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(IRI)：IRI＝FBG×FINS/22.5。采用血糖儀和血糖試紙測(cè)定大鼠FBG水平；采用全自動(dòng)生化分析儀，按照HbA1c測(cè)試盒說明書檢測(cè)大鼠HbA1c水平；采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，按照FINS酶聯(lián)免疫(ELISA)法測(cè)試盒說明書檢測(cè)大鼠FINS水平。

1.6 Western blot法測(cè)定腎組織蛋白表達(dá) 取腎皮層組織以RIPA裂解液提取蛋白，再以Lowry法測(cè)定蛋白濃度。上述蛋白進(jìn)行10%的SDS-PAGE電泳分離后，在200 mA條件下轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(2 h)，以5%的脫脂奶粉封閉液封閉1 h后，加入TBST稀釋的一抗(Wnt4稀釋比例為1∶1000；β-catenin稀釋比例為1∶1000；內(nèi)參β-actin稀釋比例為1∶5000)，4℃搖床孵育過夜。再以熒光二抗(1∶5000)37℃搖床避光孵育1 h后洗膜，用紅外激光掃描儀拍照并分析熒光條帶的灰度值，以目的條帶與β-actin灰度值的比值來(lái)表示蛋白表達(dá)量。顯色后分析膠片中的Western blot熒光條帶的灰度值[5]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以(±s)表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠FBG水平比較 見表1。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠FBG水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。給藥后，與模型組比較，達(dá)格列凈組、十一味益腎降糖方中、高劑量組大鼠FBG水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與給藥前比較，達(dá)格列凈組、十一味益腎降糖方高劑量組大鼠FBG水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組大鼠FBG水平比較(±s) mmol/L

表1 各組大鼠FBG水平比較(±s) mmol/L

與正常對(duì)照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與給藥前比較，③P＜0.05

組 別正常對(duì)照組模型組達(dá)格列凈組十一味益腎降糖方低劑量組十一味益腎降糖方中劑量組十一味益腎降糖方高劑量組n 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0給藥前5.1 4±0.3 2 1 9.7 5±1.8 9 1 9.8 1±1.9 2 1 9.7 6±1.9 1 1 9.8 8±1.9 0 1 9.9 2±1.8 0給藥后5.1 2±8.2 9 2 0.1 6±2.1 2①1 2.8 9±1.8 5②③1 8.3 8±2.1 3 1 7.9 3±1.9 2②1 6.3 8±1.8 9②③

2.2 各組大鼠HbA1c水平比較 見表2。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠HbA1c水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。給藥后，與模型組比較，達(dá)格列凈組、十一味益腎降糖方中、高劑量組大鼠HbA1c水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與給藥前比較，達(dá)格列凈組、十一味益腎降糖方中、高劑量組大鼠HbAlc水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 各組大鼠FINS、IRI水平比較 見表3。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠FINS水平升高，IRI升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。給藥后，與模型組比較，達(dá)格列凈組、十一味益腎降糖方中、高劑量組大鼠FINS水平降低，IRI顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與給藥前比較，達(dá)格列凈組、十一味益腎降糖方中、高劑量組大鼠FINS水平降低，IRI顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 各組大鼠HbA1c水平比較(±s)

表2 各組大鼠HbA1c水平比較(±s)

與正常對(duì)照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與給藥前比較，③P＜0.05

組 別正常對(duì)照組模型組達(dá)格列凈組十一味益腎降糖方低劑量組十一味益腎降糖方中劑量組十一味益腎降糖方高劑量組n H b A 1 c 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0給藥前3.7 8±0.4 2 8.5 3±0.7 4 8.5 7±0.8 0 8.5 5±0.8 9 8.6 2±0.8 4 8.5 8±0.7 9給藥后3.8 4±0.4 0 8.6 6±0.3 7①6.1 6±0.5 8②③8.2 3±0.3 9 7.6 7±0.4 0②③7.1 2±0.3 6②③

表3 各組大鼠FINS、IRI水平比較(±s)

表3 各組大鼠FINS、IRI水平比較(±s)

與正常對(duì)照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與給藥前比較，③P＜0.05

組 別n F I N S(U/m L) I R I正常對(duì)照組模型組達(dá)格列凈組十一味益腎降糖方低劑量組十一味益腎降糖方中劑量組十一味益腎降糖方高劑量組1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0給藥前2.3 7±0.1 8 8.1 4±0.5 9 8.1 8±0.4 3 8.1 7±0.4 0 8.1 6±0.3 7 8.2 1±0.3 9給藥后2.3 5±0.2 2 8.1 8±0.4 1①6.5 5±0.3 4②③8.0 4±0.3 4 7.3 7±0.4 3②③6.8 1±0.4 0②③給藥前0.5 6±0.0 6 8.7 8±0.6 0 8.7 2±0.6 5 8.7 3±0.5 8 8.7 4±0.6 3 8.7 4±0.6 3給藥后0.5 5±0.0 7 8.8 4±0.6 8①6.6 4±0.4 9②③8.3 5±0.6 2 7.7 8±0.5 5②③7.1 6±0.4 4②③

2.4 各組大鼠腎臟Wnt4、β-catenin蛋白表達(dá)比較見表4。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠Wnt4、β-catenin蛋白的表達(dá)量均明顯增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，達(dá)格列凈組、十一味益腎降糖方中、高劑量組大鼠Wnt4、β-catenin蛋白的表達(dá)量均明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

糖尿病是臨床常見的內(nèi)分泌代謝疾病，發(fā)病率僅次于腫瘤和心血管疾病，其病因和發(fā)病機(jī)制異常復(fù)雜，并發(fā)癥多且嚴(yán)重，死亡率高。糖尿病是當(dāng)前威脅全球人類健康的最重要的非傳染性疾病之一，根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟統(tǒng)計(jì)，2011年全球糖尿病患者人數(shù)已達(dá)3.7億，其中80%在發(fā)展中國(guó)家，估計(jì)到2030年全球?qū)⒂薪?.5億糖尿病患者[6]。

表4 各組大鼠腎臟Wnt4、β-catenin蛋白表達(dá)比較(±s)

表4 各組大鼠腎臟Wnt4、β-catenin蛋白表達(dá)比較(±s)

與正常對(duì)照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

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中醫(yī)藥是抗糖尿病藥物開發(fā)的重要來(lái)源。已經(jīng)有大量實(shí)驗(yàn)研究了中藥或植物藥以及其有效成分對(duì)糖尿病及相關(guān)并發(fā)癥的治療作用[2]。中醫(yī)理論認(rèn)為人的機(jī)體與環(huán)境密切相關(guān)，陰陽(yáng)處于相對(duì)平衡狀態(tài)，但飲食不節(jié)、腎虛和情志失調(diào)等因素可導(dǎo)致五臟虛弱、積熱傷津、郁火傷陰和腎精虧損等，產(chǎn)生中醫(yī)消渴的癥狀。中醫(yī)藥在治療糖尿病方面具有藥效溫和，作用持久，緩解并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展，不良反應(yīng)少，改善糖耐量等優(yōu)點(diǎn)，作用機(jī)理表現(xiàn)出多靶點(diǎn)、多向性、多層面特點(diǎn)，具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)，因此，從傳統(tǒng)中醫(yī)藥中研究開發(fā)新型抗糖尿病中藥制劑具有重要的意義和廣闊的前景[7]。

糖尿病腎病發(fā)生時(shí)，伴隨足細(xì)胞Wnt/β-catenin通路的激活、Wnt信號(hào)活化及β-catenin核易位表達(dá)的增加，該機(jī)制參與了腎細(xì)胞損傷的進(jìn)展。在該通路中Wnt4蛋白對(duì)腎小管的形成及腎臟纖維化導(dǎo)致的腎小球硬化及損傷具有重要意義。β-catenin作為經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的核心蛋白，參與細(xì)胞代謝的增殖、分化和凋亡過程，具有介導(dǎo)細(xì)胞間黏附和參與基因表達(dá)的功能[8]。

十一味益腎降糖方是依據(jù)辨證論治的原則，通過長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)篩選總結(jié)開發(fā)出的中藥復(fù)方，該制劑由黃芪、生地黃、白術(shù)、山茱萸、益母草、山藥等中藥組成，具有益氣健脾、補(bǔ)腎降糖、利水消腫之功效，方中黃芪、山藥補(bǔ)中益氣；生地黃、山茱萸止咳生津養(yǎng)陰。諸味藥合用，可發(fā)揮健脾益氣、清熱養(yǎng)陰之功效。本研究發(fā)現(xiàn)，十一味益腎降糖方中、高劑量組可使2型糖尿病模型大鼠FBG和HbA1c水平與FINS、IRI降低(P＜0.05)，并具有一定的劑量依賴性。Wnt/β-catenin信號(hào)通路介導(dǎo)了糖尿病腎損傷動(dòng)物模型的腎臟纖維化，作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)通路來(lái)調(diào)控系膜細(xì)胞功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠腎臟Wnt/β-catenin通路的表達(dá)明顯升高，由此驗(yàn)證該通路的激活參與了2型糖尿病模型大鼠腎損傷的病程進(jìn)展。十一味益腎降糖方可在一定程度上抑制大鼠腎臟Wnt/β-catenin通路的表達(dá)，對(duì)2型糖尿病所誘發(fā)的腎臟損傷具有一定的保護(hù)作用。

綜上所述，十一味益腎降糖方具有降低2型糖尿病模型大鼠血糖的作用，并通過改善胰島素抵抗、增加胰島素敏感性產(chǎn)生一定的保護(hù)作用，具有一定的開發(fā)前景。

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