李雄濤余國榮*余黎張旗鄧凱

同種異體脫鈣骨基質(zhì)（DemineralizedBoneMatrix,DBM）是一種良好的骨移植材料，具有誘導(dǎo)成骨、利于新骨形成及爬行替代等優(yōu)點[1]。臨床應(yīng)用 DBM取材于異體骨，細菌、病毒等致病微生物的污染難避免，在消毒的同時，如何更好地保持DBM的成骨誘導(dǎo)活性，仍是尚待研究的問題，所以適當(dāng)?shù)南咎幚矸绞绞种匾?。?60照射對細菌、霉菌及病毒有較好的殺滅作用[2]，故本文選用20kGy鈷-60射線對脫鈣骨基質(zhì)骨誘導(dǎo)活性的影響進行研究。PES（acid-ethanol sterilization）溶液為用含體積分數(shù)1%過氧乙酸與體積分數(shù)24%乙醇組成的過氧乙酸-乙醇消毒液，目前使用PES溶液滅活骨植入材料中的病毒有逐漸增多的趨勢[3]，Pruss等[4]研究發(fā)現(xiàn) PES溶液對脂膜病毒和非脂包膜病毒均有良好的滅活效果。目前，PES溶液滅活病毒后DBM成骨誘導(dǎo)活性是否有影響，尚沒有相關(guān)報道，故本文就 PES聯(lián)合輻照滅菌對DBM成骨誘導(dǎo)活性的影響進行相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 DBM骨膠囊的制備及滅菌

選用200 g～300 g雌性SD大鼠50只（武漢大學(xué)動物實驗中心提供），處死后取長管骨（肱骨、尺橈骨、股骨、脛腓骨）骨段壓碎后用手工磨粉器將其制作成骨粉，用分析篩篩選125 m～800 m的骨粉備用。10℃～12℃條件下，用0.6mol/L的鹽酸（pH值為2）對骨粉進行脫鈣，磁力攪拌器持續(xù)攪拌24h，更換鹽酸溶液后又脫鈣24h。用純化水反復(fù)沖洗骨粉1h。用乙醇復(fù)合溶劑進行脫脂，磁力攪拌24 h。取1/2的骨粉，用純化水進行反復(fù)震蕩沖洗40min，-40℃深低溫冰柜貯存。另1/2的骨粉用配制的PES復(fù)合溶液進行攪拌4 h后用純化水進行反復(fù)清洗震蕩40 min，-40℃深低溫冰柜貯存。將所有骨粉同時進行冷凍干燥材料24h。將經(jīng)PES處理的骨粉30 mg裝入1粒明膠膠囊中，共40粒。用20kGy的鈷-60射線進行輻照滅菌；未用PES處理的冷凍干燥骨粉每粒膠囊裝30 mg，共40粒，用20kGy鈷-60射線輻照。

1.2 動物模型的制作與分組

選用雌性200 g～300 g SD大鼠40只（武漢大學(xué)動物實驗中心提供），將80粒骨膠囊分為兩組：A組為PES溶液+20kGy鈷-60射線消毒組，設(shè)為實驗組；B組為20kGy鈷-60射線消毒組，設(shè)為對照組。大鼠以戊巴比妥鈉（25 mg/kg）腹腔注射麻醉，腰背部常規(guī)備皮、消毒、鋪巾。取腰背部正中縱形切口，長約3 cm。切開皮膚后，找到腰椎兩側(cè)腰大肌，將腰大肌鈍性分離，在兩側(cè)腰大肌內(nèi)分別植入A組和B組的DBM骨膠囊，將腰大肌原位縫合，逐層縫合傷口。術(shù)后正常飲食進水，術(shù)后當(dāng)天給每只SD大鼠肌注四環(huán)素 (Amersco公司 美國)，劑量為40 mg/kg；術(shù)后4周給每只SD大鼠（已經(jīng)處死的不再注射）腹腔注射二甲苯酚橙（國藥集團），劑量為30 mg/kg。

1.3 觀察指標

1.3.1 植入后DBM骨粉大體形態(tài)及組織形態(tài)學(xué)觀察

分別在術(shù)后2、4、6、8周處死6只 SD大鼠，將之前植入的DBM骨膠囊取出，進行大體形態(tài)觀察。

1.3.2 植入后DBM中微血管密度測定

對骨膠囊進行固定，脫水，透明，透蠟和包埋，切片，常規(guī)行HE染色，用SABC(Strept Avidin-Biotin Complex)法免疫組化觀察 CD31陽性新生血管內(nèi)皮細胞。低倍鏡（100×）下全面觀察切片以確定切片血管密度最高處，高倍鏡（200×）下以切片內(nèi)任何一個棕色染色的內(nèi)皮細胞或細胞叢作為一個血管，只要結(jié)構(gòu)不相連，其分支結(jié)構(gòu)也作為一個血管計數(shù)，記錄5個視野內(nèi)的微血管數(shù)（microvesselquantity MVQ）并取其均值。

1.3.3 新生骨生長速率測定

術(shù)后8周處死6只SD大鼠，將脫鈣骨基質(zhì)骨塊完整取出（厚度約為1.5 cm），用70%乙醇溶液固定1～2天，用70%、85%、95%、100%的乙醇逐級梯度脫水，每個濃度時間為2～3天。間歇抽真空處理（-0.64大氣壓），15min/h。二甲苯中充分透明后，加入適量甲基丙烯酸甲酯（MMA）包埋，用蒸餾水沖洗干凈樣品表面，在SM2500硬組織切片機上進行切片，切片厚度約為15 m[5]。使用激光掃描共聚焦熒光顯微鏡（德國Leica公司型號：TCSSP2 AOBSMP），對四環(huán)素（黃色熒光）和二甲苯酚橙（紅色熒光）在骨組織內(nèi)的熒光進行觀察，并通過圖像分析系統(tǒng)對兩條熒光帶之間的距離進行測量，每張切片測量10個點之間的距離，取其平均值作為新骨的生長厚度，反映新生骨成骨速率的快慢。

1.3.4 鈣、無機磷、堿性磷酸酶含量測定

術(shù)后8周將10只SD大鼠處死，將脫鈣骨基質(zhì)骨塊完整取出，清除每組各十顆DBM骨塊表面肌肉及軟組織，分別用鈣測定試劑盒（南京建成生物工程研究所C004）、無機磷測定試劑盒（南京建成生物工程研究所C006）、堿性磷酸酶檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所A059-2），按試劑盒說明，對樣本中的鈣含量、無機磷含量、堿性磷酸酶含量進行檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié)果以均數(shù)±標準差表示，采用 SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。新生微血管數(shù)量比較采用析因設(shè)計方差分析，鈣、磷、堿性磷酸酶含量比較采用 檢驗。

2 結(jié)果

2.1 植入后DBM骨粉大體形態(tài)及組織形態(tài)學(xué)觀察

術(shù)后所有大鼠均存活正常，傷口均無感染。2、4、6、8周時將DBM骨塊取出時，發(fā)現(xiàn)所有膠囊均已完全吸收，其中PES消毒液+20kGy的鈷-60射線消毒組（實驗組）所植入DBM骨粉為散在顆粒樣，無固定形狀（圖1A），20kGy的鈷-60射線消毒組（對照組）DBM 骨粉則呈卵圓形，質(zhì)地較硬，顏色灰白的骨塊（圖1B）。

圖1，DBM骨塊8周時取出后的大體形態(tài)：A為實驗組；B為對照組。

2.2 新生微血管定量分析

兩組切片在第2周時均可見較多染成棕色的微血管侵入DBM形成的骨塊中（見圖2），4周以后侵入DBM骨塊的微血管數(shù)（MVQ）下降，并保持在較為穩(wěn)定的水平（見圖3）。實驗組各周的MVQ計數(shù)均少于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）。

圖2，2周時DBM骨塊切片鏡下觀（200×）：A為實驗組，MVQ值：（9.4±1.14）；B為對照組，白色箭頭為DBM骨塊中新生微血管，MVQ值：（11.2±1.92）（彩圖見插頁）。

圖3，MVQ測定結(jié)果柱狀圖：橫軸為時間，縱軸為MVQ計數(shù)。淺色柱為實驗組、深色柱為對照組。實驗組各周的MVQ計數(shù)均少于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 新生骨生長速率定量分析

通過共聚焦熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)各組切片均有不同程度熒光染色。兩組均經(jīng)圖像分析系統(tǒng)在兩熒光標記間取10點測量距離，結(jié)果示：對照組（見圖 4-B）平均距離為 88.95 m（見圖4-B3），其生長速率為88.95/56d=1.59 m/d；實驗組（見圖4-A）僅有部分骨質(zhì)有熒光染色，而且兩種熒光重疊嚴重，無法進行寬度測量。

圖4，激光共聚焦顯微鏡熒光掃描圖像：（SD大鼠同種異體骨移植材料，15 m厚骨磨片，標尺150 m，黃色為四環(huán)素染色，紅色為二甲苯酚橙染色）。A為實驗組、B為對照組（A1、B1為黃色熒光通道，A2、B2為紅色熒光通道，A3、B3共聚焦掃描復(fù)合圖像，彩圖見插頁）。

2.4 鈣、磷、堿性磷酸酶含量測定

鈣、磷、堿性磷酸酶含量（見表1），鈣含量的測定結(jié)果：實驗組均值小于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；無機磷含量測定結(jié)果：實驗組均值小于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；堿性磷酸酶含量測定結(jié)果：實驗組均值小于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1，Ca、P、ALP含量測定結(jié)果 （n=30，±s）

表1，Ca、P、ALP含量測定結(jié)果 （n=30，±s）

注：實驗組為PES溶液+20kGy的鈷-60射線消毒組、對照組為20kGy的鈷-60射線消毒組；與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

Ca（nmol/gprot） P 含量（mmol/L） ALP 含量（U/gprot）實驗組 0.73±0.16* 8.87±0.87** 0.098±0.016*對照組 1.07±0.45 9.17±0.14 0.121±0.019

3 討論

脫鈣骨基質(zhì)（DBM）是指由同種異體骨或異種骨經(jīng)過脫鈣、脫脂、脫蛋白等處理，降低了免疫原性的骨移植材料，是理想的組織工程支架材料[6]。DBM誘導(dǎo)成骨的過程實質(zhì)就是其中所含的骨形成蛋白（BMP）和其他生長因子協(xié)同作用的過程。因為存在于骨中的BMP被礦物成份包繞，未脫鈣骨并沒有誘導(dǎo)成骨能力，脫鈣后則使BMP順利釋放，從而起誘導(dǎo)成骨的作用。間充質(zhì)細胞是可以誘導(dǎo)的成骨祖細胞（IOPC），當(dāng)其與DBM接觸，使血管的間充質(zhì)細胞被持續(xù)誘導(dǎo)，分化成軟骨和骨，Reddi將這種由骨基質(zhì)誘導(dǎo)成骨的過程描述為一種軟骨內(nèi)成骨過程[7]。本實驗中采用的是同種異體DBM，通過不同的消毒滅菌的方法后，植于大鼠肌肉組織中，能夠較好的模擬臨床上植骨所處的骨性環(huán)境，可以有效地評價其成骨誘導(dǎo)能力所受的影響。

目前大多數(shù)組織庫常使用輻照滅菌作為主要滅菌方法，鈷-60射線輻照通過激發(fā)電子以及通過促進·H和·OH自由基生成，使微生物中的蛋白、核酸等滅活而起到滅菌作用。由于劑量過大時將降低骨的誘導(dǎo)能力，40kGy的鈷-60射線輻照可以完全破壞骨移植物的骨誘導(dǎo)活性[8]，所以一直以來25kGy的鈷-60射線輻照被認為是最佳劑量，因為它既可以有效的滅菌，又能保留部分骨誘導(dǎo)能力。但Nguyen H[9]認為0-25kGy鈷-60射線輻照對誘導(dǎo)成骨能力的影響關(guān)系尚不明確，在少于25kGy鈷-60射線也可達到了滅菌標準情況下，可以選擇更小的劑量。而美國組織庫協(xié)會認為輻照滅菌劑量不應(yīng)該低于15kGy[2]，因為輻照滅菌劑量到達15kGy時才能保證滅菌水平達到安全水平。桑宏勛[8]認為鈷-60射線輻照劑量在20kGy以上時對成骨誘導(dǎo)活性有較大影響。因此我們本次實驗設(shè)計鈷-60射線輻照滅菌劑量確定為20kGy，以此評價其對成骨誘導(dǎo)活性的影響。PES溶液為體積分數(shù)1%過氧乙酸與體積分數(shù)24%乙醇組成的過氧乙酸-乙醇溶液，其中過氧乙酸有很強的殺滅病毒的作用，而乙醇可降低液體表面張力，有助于PES溶液完全滲透到DBM中[4]。因此 PES溶液對病毒有很好的滅活作用[10]，但是 PES溶液對細菌及真菌滅活效果不理想，特別是對黑曲霉的滅活效果差[5]。鐘昱文[11]通過模擬現(xiàn)場消毒試驗，結(jié)果表明，含量為1000 mg/L的過氧乙酸對30個染菌作用10 min后，平均僅殺滅3個以上對數(shù)值。而20kGy的鈷-60射線滅菌效果確切，所以我們將DBM經(jīng)PES溶液處理后再加用20kGy的鈷-60射線消毒，以此來評價PES聯(lián)合輻照滅菌對DBM成骨誘導(dǎo)活性的影響。

從DBM骨塊取出后的大體情況看，20kGy的鈷-60射線消毒（對照組）后骨塊形態(tài)較為完整（見圖1-B），而PES溶液+20kGy的鈷-60射線消毒（實驗組）后取出骨塊形態(tài)不完整，大部分呈散在顆粒狀（見圖1-A）。鈣、磷、堿性磷酸酶含量測定結(jié)果顯示：實驗組鈣、磷、堿性磷酸酶含量均小于對照組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。以上實驗結(jié)果均說明PES聯(lián)合輻照滅菌對DBM骨誘導(dǎo)活性有負面影響。

由于血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）一定程度可以啟動并促進BMP的表達。術(shù)后7～28天為VEGF的表達高峰期，而VEGF和血管的重建密切相關(guān)[12]，所以在第2周時均可見較多微血管侵入 DBM 形成的骨塊中，而4周以后侵入DBM骨塊的微血管數(shù)反而下降。對照組切片的微血管計數(shù)（MVQ）均大于實驗組，說明PES聯(lián)合輻照滅菌對DBM骨誘導(dǎo)活性有負面影響。

通過共聚焦熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)各組切片均有不同程度熒光染色。我們在兩組圖像分析系統(tǒng)中任意取10點測量熒光帶間的距離，而傳統(tǒng)的距離測量法來測量新生骨生長速率是通過兩熒光標記間最寬的的距離來計算的[13]，用傳統(tǒng)方法測量B組兩熒光標記間最寬的的距離為110.96 m，其速率為110.96

m/56 d=1.98 m/d，而A組熒光染色重疊嚴重，同樣可以提示對照組的成骨誘導(dǎo)活性優(yōu)于實驗組。另外，從圖4可以看到，有部分熒光染色部分重疊，這可能是由于四環(huán)素代謝需要一定時間[14]，所以對新骨部位經(jīng)過共聚焦顯微鏡熒光掃描后發(fā)現(xiàn)兩次熒光標記帶有部分重疊，隨著四環(huán)素的代謝和新骨生長，新生骨染色應(yīng)以二甲苯酚橙染成紅色為主 (見圖4-B3)，說明對照組新生骨生長較為正常。如果兩種不同熒光標記顏色無法分開(見圖4-A3)，則提示新生骨生長較為緩慢。說明PES聯(lián)合輻照滅菌對DBM成骨誘導(dǎo)活性有負面影響。

綜上所述，上述實驗結(jié)果均說明PES溶液消毒對脫鈣骨基質(zhì)骨誘導(dǎo)活性的影響較輻照滅菌大。其作用機理可能如下：過氧乙酸可能會直接攻擊骨形成蛋白，影響它的活性；過氧乙酸可能會破壞骨膠原和骨基質(zhì)空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，骨形成蛋白在發(fā)揮作用時需要支架，而骨膠原是骨形成蛋白的最好支架[15]，缺少了支架骨形成蛋白的作用的發(fā)揮就受到限制。

因此，我們認為PES聯(lián)合輻照滅菌滅活病毒后，對DBM的成骨誘導(dǎo)能力有一定的負面影響。但是臨床上我們通常是在骨缺損的情況下進行植骨，所以在骨性環(huán)境下PES聯(lián)合輻照滅菌對DBM成骨誘導(dǎo)能力的影響有多大，還有待進一步研究。

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