王 鶴 李 江 黃興文 黃詩(shī)婭

貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550002

吉祥草與余甘子均為貴州十大苗藥，藥用資源廣泛。吉祥草為百合科植物Reineckeacarnea(Aner.) Kunth的干燥全草[1-3]，在貴州、湖南、廣西等苗族人口主要聚集區(qū)使用較為廣泛[4]，具有滋陰潤(rùn)肺、涼血止血、解毒利咽之功效，用于肺燥咳喘，陰虛咳嗽，咳血，治療肺熱咳嗽，跌打損傷，瘡毒等[5]。余甘子為大戟科葉下珠屬(Phyllanthus)植物余甘子PhyllanthusemblicaL.的干燥成熟果實(shí)[6]，系藏、苗族民間常用藥[7]，具有清熱涼血，消食健胃，生津止渴之功效。用于血熱血瘀，消化不良，腹脹，咳嗽，喉痛，口干。吉祥草長(zhǎng)于解毒清肺止咳，余甘子長(zhǎng)于清熱潤(rùn)肺化痰，兩藥相需配伍共奏清熱解毒、潤(rùn)肺止咳化痰之功。課題組調(diào)查發(fā)現(xiàn)民間將兩藥配伍應(yīng)用，用于治療肺癌具有較好的療效。為了進(jìn)一步提高兩藥配伍療效，實(shí)驗(yàn)建立總皂苷、總黃酮、沒(méi)食子酸的含量測(cè)定方法，采用正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化吉祥草配伍余甘子提取工藝。

1 儀器與材料

1.1 儀器 日立Primaide高效液相色譜儀(天美科學(xué)儀器有限公司)； JA2003N電子分析天平；721型可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.2 材料 吉祥草采于貴州六枝縣，經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院生藥教研室孫慶文教授鑒定為百合科吉祥草屬植物吉祥草Reineckiacarnea(Andr.)Kunth 的帶根全草；余甘子產(chǎn)地為貴州晴隆縣，藥材經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院生藥教研室孫慶文教授鑒定為大戟科葉下珠屬(Phyllanthus)植物余甘子PhyllanthusemblicaL.的成熟果實(shí)。吉祥草、余甘子對(duì)照藥材購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所；薯蕷皂苷購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司；沒(méi)食子酸購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所；蘆丁對(duì)照品購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司。

2 方法及結(jié)果

2.1 總皂苷含量測(cè)定[8]

2.1.1 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)定配伍藥材(吉祥草∶余甘子=2∶1)粗粉5.0 g，甲醇回流提取4 h，回收甲醇，加入蒸餾水使之溶解，濾過(guò)，濾液轉(zhuǎn)移至100 mL的容量瓶中加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。準(zhǔn)確吸取10 mL于分液漏斗中，用石油醚分6次萃取，每次用量分別為15、10、10、10、10、10 mL，取水層用水飽合正丁醇溶液萃取4次，每次用量分別為15、10、10、10 mL，合并正丁醇萃取液并用正丁醇飽和水溶液20 mL洗滌，回收正丁醇液至干，殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ萦?5 mL容量瓶中，作為供試品溶液。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取薯蕷皂苷對(duì)照品(干燥至恒重)1.21 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液(121 μg/mL)。

2.1.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 分別精密吸取對(duì)照品溶液1.5 mL、供試品溶液0.6 mL置于具塞試管中，揮干甲醇，再分別加入5%的香草醛冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，搖勻，密塞，于60℃水浴顯色15 min，取出后立即用冰水冷卻5 min，再加入5 mL冰醋酸稀釋?zhuān)瑩u勻，靜置10 min，在200～900nm進(jìn)行掃描，結(jié)果如圖1、圖2所示。兩者均在460 nm處，有最大吸收峰。

2.1.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密移取薯蕷皂苷對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL置于具塞試管中，揮干甲醇，再分別加入5%的香草醛冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，搖勻，密塞，60℃水浴顯色15 min，取出后立即用冰水冷卻5 min，再加入5 mL冰醋酸稀釋?zhuān)瑩u勻，靜置10 min，于460 nm處測(cè)定其吸光度。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，回歸方程為：y=0.0251x-0.0190(R=0.9996，n=6)，結(jié)果表明：薯蕷皂苷在4～24 μg/mL濃度范圍與吸光度成良好的線(xiàn)性關(guān)系，如圖3所示。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 吸取對(duì)照液0.8 mL，共6份，按2.1.3項(xiàng)下的操作方法顯色，于460 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD=1.71%，結(jié)果表明方法的精密度良好，見(jiàn)表1。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取樣品溶液0.4 mL，按2.1.3項(xiàng)下的操作方法顯色，于460 nm處分別在0、15、30、45、60、90、120 min測(cè)定吸光度，結(jié)果表明樣品液顯色后在120 min內(nèi)穩(wěn)定，RSD=0.86%，結(jié)果見(jiàn)表1。2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批配伍藥材6份，每份5g，按2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，另取供試品溶液0.4 mL按2.1.3項(xiàng)下操作方法顯色，于460 nm處測(cè)定吸光度，并計(jì)算含量，結(jié)果平均含量為1.40%，RSD=1.50%。結(jié)果表明方法的重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收試驗(yàn) 精密稱(chēng)取2.1.7項(xiàng)下已知含量的同一批次配伍藥材2.5g，共6份，分別加入等量薯蕷皂苷對(duì)照品適量，按2.1.3項(xiàng)下的操作方法顯色，于460 nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2 沒(méi)食子酸含量測(cè)定[9-10]

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Venusil XBP C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇：0.3%磷酸水(4∶96)；柱溫：30℃；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：273 nm。理論塔板數(shù)按沒(méi)食子酸峰計(jì)算，應(yīng)不低于2000。

表1 穩(wěn)定性試驗(yàn)考察結(jié)果

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)定配伍藥材(吉祥草：余甘子=2∶1)粗粉0.2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱(chēng)定重量，回流1 h，放冷，再稱(chēng)定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，作為供試品溶液。2.2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取沒(méi)食子酸對(duì)照品0.026 20 g，置于25 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取0.7 mL上述溶液于10 mL容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL含73.36 μg的對(duì)照品溶液。

2.2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密吸取上述溶液0.2、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL分別置于10 mL容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻。按上述色譜條件，進(jìn)樣體積10μL，測(cè)定沒(méi)食子酸峰面積。其HPLC出峰情況見(jiàn)圖4。以沒(méi)食子酸峰面積值Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，求得沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程和線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)分別為Y=3 159.3X-53 921(r=0.999 5)，結(jié)果表明沒(méi)食子酸進(jìn)樣量在0.419 2～0.943 2 μg內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，結(jié)果如圖5所示。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，記錄峰面積，結(jié)果表明，RSD為1.39，小于3%，表明儀器的精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，在上述色譜條件下，分別于0、1、3、6、9、12 h時(shí)進(jìn)樣，記錄峰面積，結(jié)果表明，峰面積的RSD值為0.98%，表明樣品溶液在室溫條件下12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。結(jié)果見(jiàn)表4。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批配伍藥材6份，按“2.2.2”項(xiàng)下進(jìn)行操作，制成供試品溶液，測(cè)定沒(méi)食子酸的含量 (mg/g)，結(jié)果平均含量為32.477 mg/g，RSD為1.29%，表明重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取2.2.7項(xiàng)下已知含量的同一批次配伍藥材2.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入1.048 mg/mL的沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液1.1 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備項(xiàng)下方法制備供試液，在上述色譜條件下測(cè)定沒(méi)食子酸含量，計(jì)算平均加樣回收率和RSD。結(jié)果樣品中沒(méi)食子酸的平均回收率為98.11%，RSD為2.40%。結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)考察結(jié)果

表5 加樣回收率試驗(yàn)考察結(jié)果

2.3 總黃酮含量測(cè)定[11]

2.3.1 供試品溶液制備 精密稱(chēng)定配伍藥材(吉祥草：余甘子=2∶1)粗粉0.5 g，精密加入60%乙醇50 mL，回流提取1.5 h，取出，放冷，用60%乙醇補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液，備用。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品5.12 mg，60%乙醇微熱溶解并定容至25 mL，搖勻，得濃度為0.204 8 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3.3 最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定 準(zhǔn)確吸取蘆丁對(duì)照品溶液1.0 mL，置于具塞試管中，加入60%乙醇至5 mL，再加入5%亞硝酸鈉0.3 mL搖勻，放置6 min；加入10%硝酸鋁0.3 mL搖勻，放置6 min；加入1%NaOH溶液4 mL；加水0.4 mL，搖勻后放置15 min，在200～800 nm處進(jìn)行最大吸光度的掃描。結(jié)果表明波長(zhǎng)在508 nm處有最大吸光度。

2.3.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 準(zhǔn)確吸取蘆丁對(duì)照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0于6只具塞試管中，分別加入體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇溶液至5 mL；加入5%亞硝酸鈉0.3 mL搖勻，放置6 min；加入10%硝酸鋁0.3 mL搖勻，放置6 min；加入1% NaOH溶液4 mL；加入水0.4 mL，搖勻后放置15 min，以0.0 mL作為空白，于508 nm處測(cè)定各自吸光度，并以蘆丁含量的濃度作為橫坐標(biāo)，以該濃度下所測(cè)定的吸光度作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并求出該標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)下對(duì)應(yīng)的回歸方程，回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為：Y=10.493X-0.012，R2=0.9996，結(jié)果表明，蘆丁在0.02～0.10 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。如圖6所示。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液2 mL，共6份，按“2.3.3”項(xiàng)下顯色方法顯色，于508 nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果見(jiàn)表，計(jì)算吸光度RSD值為1.77%。結(jié)果表明，該方法精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液0.4 mL，按“2.3.3”項(xiàng)下顯色方法顯色，于508 nm處分別在0，15，30，45，60，90 min測(cè)定吸光度，結(jié)果見(jiàn)表7;計(jì)算吸光度RSD值為1.16%。結(jié)果表明，該方法表明樣品溶液在90 min內(nèi)基本保持穩(wěn)定，所以，應(yīng)該在樣品顯色后90 min內(nèi)進(jìn)行吸光度的測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表6。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取2.3.6項(xiàng)下已知含量的同一批次配伍藥材6份，按“2.3.1”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，取0.4 mL供試品溶液照“2.3.4”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備方法，自“加入60%乙醇溶液至5 mL”起，依法測(cè)定吸光度，計(jì)算含量，結(jié)果平均含量為8.75%，RSD為2.01%，表明重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取2.3.7項(xiàng)下已知含量的同一批配伍藥材2.5 g，共6份，精密加入5 mL濃度為4.32 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，搖勻，按供試品制備方法制備供試品溶液，取供試品溶液樣品1 mL，照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備項(xiàng)下的方法，自“加入60%乙醇溶液至5 mL”起，依法測(cè)定吸光度。結(jié)果計(jì)算回收率為96.62%，RSD為1.48%。結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 加樣回收率試驗(yàn) (n=6)

2.4 供試品提取工藝優(yōu)化

2.4.1 因素與水平設(shè)計(jì) 前期對(duì)吉祥草配伍余甘子不同提取物及有效部位組合藥效學(xué)進(jìn)行比較研究后，篩選出最佳提取方法為60%乙醇滲漉提取，為使有效部位中各有效成分最大程度的富集，以浸泡時(shí)間、60%乙醇用量、滲漉速度作為因素，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，最后以總皂苷含量、沒(méi)食子酸含量、總黃酮含量總和以及得膏率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選最佳的有效部位提取方法，分析見(jiàn)表8。

2.4.2 正交試驗(yàn)及結(jié)果 稱(chēng)取吉祥草36g，余甘子18g，浸泡前先用60%乙醇54mL浸潤(rùn)30min。分別按表8條件進(jìn)行試驗(yàn)，制得共9號(hào)干膏。吉祥草配伍余甘子滲漉提取工藝中各因素對(duì)結(jié)果影響的主次順序?yàn)椋篊>B>A。具方差分析結(jié)果可知，各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有顯著的影響，綜合考慮各方面因素，實(shí)驗(yàn)最終選擇最佳的滲漉工藝為：A1B2C1即藥材經(jīng)過(guò)浸潤(rùn)后浸泡4 h，提取溶劑用量為15倍量，滲漉速度為1 mL/min。

表8 因素水平表

浸膏號(hào)編號(hào)沒(méi)食子酸含量總皂苷含量總黃酮含量含量總和/%15.73±0.0413.37±0.118.57±0.0627.6725.05±0.1113.00±0.127.98±0.1026.0334.74±0.339.30±0.398.68±0.6822.7243.45±0.369.85±0.147.95±0.0621.2554.41±0.3612.24±0.548.27±0.1524.9265.62±0.1210.33±0.128.36±0.3624.3175.49±0.2410.85±1.158.28±0.2624.6285.59±0.0512.01±0.007.48±0.2925.0896.16±0.1211.21±0.058.05±0.2125.42

表10 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

續(xù)表

表10 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

總評(píng)分=(含量總和測(cè)定值/含量總和最大值)×65+(得膏率測(cè)定值/得膏率最大值)×35

2.4.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 稱(chēng)取吉祥草36g，余甘子18g，3批，浸泡前先用60%乙醇54mL浸潤(rùn)30min后浸泡4h，用提取溶劑用為15倍量滲漉，滲漉速度為1mL/min，滲濾液減壓干燥得干膏，按上述建立含量測(cè)定方法進(jìn)行含量測(cè)定，表明含量測(cè)定符合優(yōu)選出的工藝，工藝穩(wěn)定，合理可行。結(jié)果見(jiàn)表11。

表11 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

吉祥草與余甘子(2∶1)配伍，分別采用不同的提取方法，所得浸膏配成藥液后作用于非小細(xì)胞肺癌實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，結(jié)果對(duì)腫瘤模型小鼠生活質(zhì)量有不同程度的改善，其中60%乙醇滲漉提取法優(yōu)于其他方法。研究顯示，60%乙醇滲漉提取部位能夠較大程度的富集黃酮、皂苷等主要抗腫瘤成分，故采用60%乙醇滲漉法提取。為使最佳提取部位中各有效成分最大程度富集，以浸泡時(shí)間、60%乙醇用量以及滲漉速度作為因素，并以沒(méi)食子酸含量、總黃酮含量、總皂苷含量總和以及得膏率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化60%乙醇滲漉提取工藝。最終選擇最佳條件是藥材浸潤(rùn)后浸泡4h，提取溶劑用量為15倍量，滲漉速度為1mL/min。

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