張紫璇，韓明子，高 旭，李遠(yuǎn)超，孟 媛，李卓昕，王美淇，劉晉宇

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院 動物醫(yī)學(xué)系，吉林 延吉133000；2.延邊州動物疫病預(yù)防控制中心，吉林 延吉133000)

干擾素(Interferon，IFN)是宿主細(xì)胞在病毒或特定的誘生劑作用下產(chǎn)生的一類分泌型多功能糖蛋白，有廣譜抗病毒、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫功能的作用[1]，是重要的細(xì)胞因子之一。1995年，Lowenthal等從雞脾淋巴細(xì)胞中得到與哺乳動物γ干擾素(IFN-γ)功能相似的IFN[2]。Digby等用RT-PCR方法從被誘導(dǎo)的T細(xì)胞中獲 得 了IFN-γ基 因[3]。1999年，Lambrecht等分別表達(dá)了IFN-Ⅰ和IFN-Ⅱ并進(jìn)行活性研究，表明E.coli和COS細(xì)胞表達(dá)的IFN與天然IFN同樣具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用，且II型IFN-γ干擾素的免疫調(diào)節(jié)能力強(qiáng)于IFN-I[4]。

改造過的禽痘病毒(Fowlpox virus，F(xiàn)PV)表達(dá)外源蛋白的非必需區(qū)序列較長，并且FPV基因組序列十分龐大，又能夠通過磷酸化，糖基化等修飾外源蛋白，有利于外源蛋白的表達(dá)[5]。本研究為了更好的發(fā)揮FPV作為疫苗活載體的優(yōu)勢，將鵝IFN-γ基因(GoIFN-γ)重組至FPV，研究GoIFN-γ能否在FPV中穩(wěn)定表達(dá)，以及能否抑制鵝細(xì)小病毒(GPV)的活性，為共表達(dá)GPV VP3基因和IFN-γ基因的重組痘病毒疫苗研究和免疫學(xué)評價(jià)奠定基礎(chǔ)，同時(shí)對進(jìn)

一步闡明IFN-γ在免疫系統(tǒng)中的作用原理和特點(diǎn)具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 種毒與載體pSY538、pSC11、pSY681質(zhì)粒和S-FPV-017株FPV(2.13×106pfu/mL)由哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈；pMD18T-IFN-γ由延邊大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存[6]；GPV YBYJ株(GPV)由延邊大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存[7]。

1.2 雞胚與主要試劑9日齡SPF雞胚購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司；ExTaq酶，X-gal和限制性內(nèi)切酶均購自寶生物工程(大連)有限公司；小鼠抗鵝IFN-γ蛋白多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備；山羊抗小鼠IgG-FITC購自Affinity Biosciences；DMEM培養(yǎng)液購自Gibco公司；Endo-free Plasmid Mini KitⅠ購自O(shè)mega公司；X-tremeGENETMHP DNA Transfection Reagent購 自SIGMA-ALDRICH公司；VirusGen Purification Kit購自康為世紀(jì)公司。

1.3 含GoIFN-γ基因轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建 根據(jù)Gen-Bank中登錄的GoIFN-γ基因(JX966250)的核苷酸序列[8]，使用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)合成1對引物(P1：5'-GAATTCATGACTTGCCAGACCTACTGCTT-3'/P2：5'-GAATTCTTATTAACATCTGCATCTCTTTGG-3')，在引物的兩端加入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，以pMD18TIFNγ為模板進(jìn)行GoIFN-γ基因全序列擴(kuò)增，擴(kuò)增片段的長度為495 bp。將擴(kuò)增的目的片段回收純化后克隆至載體pSY538中早晚期啟動子LP2EP2下游的EcoRⅠ位點(diǎn)，構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pSY538-IFNγ；通過SmaⅠ位點(diǎn)將質(zhì)粒pSC11中在晚期啟動子P11控制下的LacZ基因報(bào)告盒插入pSY538-IFNγ質(zhì)粒中，構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pSY538-IFNγ-LacZ；再用NotⅠ酶切pSY538-IFNγ-LacZ質(zhì)粒，獲得LP2EP2控制下的IFN-γ-LacZ基因，將其克隆至含有FPV復(fù)制非必需區(qū)的pSY681載體的NotⅠ位點(diǎn)，構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pSY681-IFNγ-LacZ。參照OMEGA Endo-free Plasmid Mini KitⅠ使用說明純化質(zhì)粒pSY681-IFNγ-LacZ并利用NotⅠ酶切鑒定該質(zhì)粒。

1.4 重組FPV的篩選與純化 待六孔板中雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)匯合度達(dá)80 %時(shí)30μL/孔加入FPV S-FPV-017，37℃孵育2 h，按照X-tremeGENETMHP DNA Transfection Reagent使用說明轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pSY681-IFNγ-LacZ，6 h后換為完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收獲病毒，反復(fù)凍融后1 200 r/min離心，收獲上清病毒，用無血清的DMEM培養(yǎng)液作10倍倍比稀釋后分別接種于單層CEF，37℃感作2 h，棄液，加入含有1.5 %低熔點(diǎn)瓊脂糖的DMEM固體培養(yǎng)基，細(xì)胞出現(xiàn)典型CPE后加入X-gal至終濃度為300μg/mL的DMEM營養(yǎng)瓊脂進(jìn)行染色，繼續(xù)培養(yǎng)12 h～16 h，挑取藍(lán)色蝕斑溶于1 mL無血清DMEM培養(yǎng)液中。凍融3次后進(jìn)行下一輪純化，直至篩選到穩(wěn)定的重組FPV。

1.5 重組FPV的PCR鑒定 收獲含重組病毒rFPV-IFNγ-LacZ的細(xì)胞反復(fù)凍融后，1 200 r/min離心后收取上清病毒，37℃5 % CO2條件下利用含3 %血清的DMEM擴(kuò)大培養(yǎng)后，按照VirusGen Purification Kit使用說明提取rFPV-IFNγ-LacZ的核酸為模板，采用P1/P2引物進(jìn)行PCR鑒定。

1.6 重組FPV的間接免疫熒光(IFA)檢測 分別將重組病毒rFPV-IFNγ-LacZ和親本病毒S-FPV-017接種六孔板內(nèi)單層CEF，培養(yǎng)72 h至細(xì)胞出現(xiàn)明顯CPE后用PBS清洗并用冷丙酮固定10 min后棄液，自然晾干后以鼠抗鵝IFN-γ蛋白多克隆抗體(1∶100)為一抗，山羊抗小鼠IgG-FITC(1:800)為二抗，分別進(jìn)行IFA檢測。

1.7 抗病毒活性檢測 將rFPV-IFNγ-LacZ接種于單層CEF，在37℃5 % CO2條件下培養(yǎng)96 h，收獲上清，利用0.22μm的微孔濾膜過濾接種于12孔板內(nèi)單層CEF(2×106cell/孔)，培養(yǎng)12 h后棄液，加入100TCID50的GPV孵育2 h后棄液，加入維持液培養(yǎng)至待陽性對照出現(xiàn)明顯CPE時(shí)，采用細(xì)胞病變抑制法檢測重組FPV表達(dá)的GoIFN-γ蛋白的抗病毒活。同時(shí)設(shè)立GPV陽性對照組和空白對照組，每組重復(fù)4孔。

2 結(jié)果

2.1 pSY681-IFNγ-LacZ轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建 重組質(zhì)粒pSY681-IFNγ-LacZ轉(zhuǎn)移載體含有早晚期啟動子LP2EP2控制的IFN-γ基因，晚期啟動子P11控制的LacZ基因和親本禽痘病毒同源序列(圖1)。重組質(zhì)粒經(jīng)NotⅠ酶切鑒定，結(jié)果顯示獲得兩條特異性條帶，與預(yù)期相符(5 878 bp和3 700 bp)(圖2)。將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒測序，結(jié)果顯示序列正確，表明正確構(gòu)建pSY681-IFNγ-LacZ轉(zhuǎn)移載體。

圖1 轉(zhuǎn)移載體pSY681-IFNγ-LacZ的結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Map of transfer plasimid pSY681-IFNγ-LacZ

圖2 重組質(zhì)粒pSY681-IFNγ-LacZ的酶切鑒定Fig.2 Identification of pSY681-IFNγ-LacZ by NotⅠdigestion

2.2 重組禽痘病毒的篩選及PCR鑒定 將重組質(zhì)粒pSY681-IFNγ-LacZ轉(zhuǎn)染親本病毒S-FPV-017經(jīng)同源重組篩選到重組病毒rFPV-IFNγ-LacZ，因其含有LacZ報(bào)告基因，經(jīng)9輪篩選后可見在含有X-gal的固體培養(yǎng)基中全部為藍(lán)色蝕斑(圖3)，表明獲得了能夠穩(wěn)定表達(dá)LacZ的重組病毒。提取重組病毒DNA為模板，PCR鑒定結(jié)果顯示擴(kuò)增獲得了500 bp的GoIFN-γ基因片段(圖4)，表明篩選獲得了含GoIFN-γ的重組FPV。

圖3 重組禽痘病毒的篩選Fig.3 The selection of recombinant FPV

圖4 重組FPV的PCR鑒定Fig.4 Identification of GoIFN-γgene in rFPV-IFNγ-LacZ by PCR

2.3 重組FPV表達(dá)IFN-γ蛋白的IFA檢測 分別將重組病毒rFPV-IFNγ-LacZ和親本病毒S-FPV-017接種六孔板內(nèi)單層CEF，利用IFA進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，rFPV-IFNγ-LacZ感染的CEF在胞內(nèi)和胞漿中均出現(xiàn)特異性熒光反應(yīng)，親本病毒S-FPV-017感染的CEF未出現(xiàn)熒光反應(yīng)(圖5)。表明rFPV-IFNγ-LacZ表達(dá)了IFN-γ蛋白。

2.4 重組FPV抗病毒的活性檢測 將rFPV-IFNγ-LacZ和鵝細(xì)小病毒于CEF中共培養(yǎng)，待GPV陽性對照組細(xì)胞出現(xiàn)明顯CPE后時(shí)，而rFPV-IFNγ-LacZ試驗(yàn)組細(xì)胞貼壁情況良好，有少量懸浮細(xì)胞，未出現(xiàn)明顯CPE(圖6A)；空白對照組細(xì)胞正常生長(圖6B)。表明重組病毒rFPV-IFNγ-LacZ表達(dá)的IFN-γ在體外具有良好的抗病毒活性，能夠抵抗GPV對細(xì)胞的感染。

圖5 rFPV-IFNγ-LacZ感染CEF的IFA鑒定結(jié)果Fig.5 Identification of the rFPV-IFNγ-LacZ by IFA

圖6 重組FPV表達(dá)的GoIFN-γ在CEF中抗GPV活性的檢測Fig.6 Antiviral activity of GoIFN-γexpressed from rFPV-IFNγ-LacZ against GPV in CEF

3 討論

IFN-γ具有嚴(yán)格的選擇性，靶向作用于非正常細(xì)胞，能夠使機(jī)體迅速產(chǎn)生反應(yīng)并長時(shí)間處于抗病毒狀態(tài)，但是只有在特定的病原刺激下被抑制的IFN-γ才能表達(dá)，與此同時(shí)動物體內(nèi)分泌的IFN-γ數(shù)量有限，在很大程度上制約了IFN的廣泛應(yīng)用。因此，建立一個(gè)高效而又穩(wěn)定的表達(dá)系統(tǒng)至關(guān)重要。IFN原核表達(dá)真核基因時(shí)在一定程度上真核基因的信號肽會影響基因表達(dá)產(chǎn)物的活性[9]。所以本研究利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對IFN-γ基因進(jìn)行了體外真核表達(dá)，獲得了能夠穩(wěn)定表達(dá)IFN-γ基因的重組病毒。

隨著活載體疫苗的不斷開發(fā)，痘病毒(包括FPV)作為較成熟的多效病毒載體已表達(dá)數(shù)10種不同的保護(hù)性抗原[10]，在美國，表達(dá)新城疫病毒Hitchner B株HN基因和F基因，Texas株HN基因和F基因的重組FPV疫苗已經(jīng)被使用[11]，實(shí)踐證明重組禽痘疫苗可以使免疫雞對強(qiáng)毒產(chǎn)生良好的免疫效果。但是與常規(guī)疫苗相比其免疫的雛雞存在體重減輕和免疫抑制[12]，為了減少FPV殘留的毒性，嘗試在疫苗中引入細(xì)胞因子作為佐劑[13]。Schijns等將重組桿狀病毒表達(dá)的貓IFN-γ作為滅活狂犬病疫苗的免疫佐劑免疫3月齡貓，與單獨(dú)使用滅活狂犬疫苗相比其血清中抗體滴度顯著提高[14]。Rautenschlein等融合表達(dá)火雞紐卡斯?fàn)柌〔《竞虸FN-II的疫苗接種SPF火雞胚，與單獨(dú)接種紐卡斯?fàn)柌《疽呙绲幕痣u胚相比，孵化率和存活率無變化的情況下同時(shí)出現(xiàn)輕微的增重效應(yīng)，前者提前一周產(chǎn)生抗紐卡斯?fàn)柌《究贵w并具有良好的免疫保護(hù)能力[15]。IFN-γ作為免疫佐劑具有增重效應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)功能，能夠增強(qiáng)機(jī)體的抗感染能力，并減少免疫原性蛋白基因重組疫苗的毒副作用。本實(shí)驗(yàn)用FPV表達(dá)載體表達(dá)IFN-γ基因可用于體外人工制備IFN，也為研制GoIFN-γ疫苗佐劑和共表達(dá)保護(hù)性抗原和IFN-γ的重組基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。

細(xì)胞病變抑制法測定重組GoIFN-γ的抗病毒活性，結(jié)果顯示重組FPV表達(dá)的IFN-γ蛋白能夠有效抑制GPV介導(dǎo)的CEF表面抗原的表達(dá)。Mallick等[16]在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的雞IFN-γ和劉新文等[17]應(yīng)用酵母分泌表達(dá)的雞IFN-γ均對水泡口炎病毒在CEF中的增殖具有抑制效果。這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是一致的，表明真核系統(tǒng)表達(dá)IFN-γ在體外具有抗病毒活性，但I(xiàn)FN-γ的其它活性功能還需要進(jìn)一步探究。

IFN的活性具有相對的種屬特異性，所以其不僅對同種屬或相近種屬的動物及其細(xì)胞有保護(hù)力，對不同種屬的動物及其細(xì)胞也可能具有保護(hù)作用。如猴的IFN基因不僅對猴有保護(hù)作用，對兔和人也有一定的作用。GoIFN-γ除對鵝外，對其它種屬相近的禽類或者其它的脊椎動物也可能具有保護(hù)作用。對此本研究團(tuán)隊(duì)將進(jìn)一步深入研究。