馮凱 鄭燕華 楊鶴鳴 王奎 張剛 岳茂興, 尹進(jìn)南

膿毒癥是創(chuàng)傷、手術(shù)后嚴(yán)重的并發(fā)癥,是目前外科和急診重要的死亡原因[1]。膿毒癥的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,與感染和機(jī)體非特異性炎癥反應(yīng)密切相關(guān),引起全身性炎癥反應(yīng)和繼發(fā)性免疫抑制,最終可導(dǎo)致多器官功能衰竭[2-4]。膿毒癥起病急,涉及全身多個(gè)系統(tǒng),各種機(jī)體對(duì)內(nèi)外原性刺激交替反應(yīng),形成復(fù)雜的反應(yīng)網(wǎng)絡(luò),因此目前還沒(méi)有特異性好、敏感性高的生物標(biāo)志物來(lái)檢測(cè)膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)測(cè)預(yù)后[5-8]。更因?yàn)槟摱景Y的發(fā)生機(jī)制沒(méi)有系統(tǒng)闡明,目前也沒(méi)有有效的靶點(diǎn)達(dá)到個(gè)性化的診斷和治療[9]。筆者建立膿毒癥小鼠模型,觀察在膿毒癥發(fā)生發(fā)展關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)上血清蛋白質(zhì)組學(xué)維度上的變化[10],確定重要的生物標(biāo)志物,研究其生成來(lái)源,發(fā)生機(jī)制,將有助于膿毒癥的診斷、預(yù)后和治療。

材料和方法

一、材料與方法

1.動(dòng)物模型及分組

雌性C57BL/6小鼠,體重19～23 g,共85只小鼠分為假手術(shù)組(Sham組，18只)和盲腸結(jié)扎加穿孔組(sepsis組，67只)。分四批次完成實(shí)驗(yàn),第1～3批次,每次20只實(shí)驗(yàn)小鼠,3只Sham小鼠,17只sepsis小鼠,手術(shù)8 h,取1只Sham,2只sepsis;32 h取1只Sham,2只sepsis;72 h取1只Sham,sepsis全部處死取材。第4批實(shí)驗(yàn),25只實(shí)驗(yàn)小鼠,9只Sham,每個(gè)時(shí)項(xiàng)點(diǎn)取3只。16只sepsis,補(bǔ)足sepsis組各時(shí)項(xiàng)只數(shù)達(dá)到10只左右。

2.實(shí)驗(yàn)方法

動(dòng)物模型參考Remick等[11]建立的方法,假手術(shù)組僅行腹部切口與縫合;膿毒癥組行盲腸結(jié)扎加穿孔(22G針頭)。手術(shù)前1 d轉(zhuǎn)養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室,禁食16 h,自由飲水。研究期間小鼠處于室溫20℃的房間,12 h光亮,12 h黑暗循環(huán); 用150～200 μL氯胺酮(100 mg/kg體重)麻醉小鼠,腹部消毒,沿腹下部中線(xiàn)切口,暴露盲腸后,用6.0號(hào)手術(shù)線(xiàn)在回盲瓣下進(jìn)行結(jié)扎,然后用22G的注射器針頭穿透盲腸,從針孔處各擠出一滴腸內(nèi)容物,將盲腸放回腹腔,縫合切口;假手術(shù)組不進(jìn)行盲腸結(jié)扎和穿孔,其它與膿毒癥小鼠模型一致。小鼠術(shù)后立刻在皮下注射0.1 mL溫生理鹽水,術(shù)后各組動(dòng)物均自由進(jìn)食飲水。

3.樣本采集

摘除眼球取血,室溫靜置3 h,于2 500 rpm離心5 min,血清分裝,每管300 μL,凍存于-70℃冰箱中備用。

4.病理生理學(xué)檢測(cè)方法

小腸及重要器官病理學(xué)檢查:Sham及CLP組取回盲部以上一段小腸、肺臟、心臟、肝臟、及腎臟、脾臟全部,10%中性福馬林固定,石蠟切片包埋,HE染色,光鏡鏡檢。其余組織液氮保存。

5.iTRAQ檢測(cè)

iTRAQ檢測(cè)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行[12],取24個(gè)樣本,同組同時(shí)相4個(gè)樣本,兩兩隨機(jī)等體積混合形成12個(gè)樣本。12個(gè)樣本各取一份制成1份混合樣本。樣品用裂解緩沖液(8M尿素,0.1M TrI HCl,pH值8.5,20mM DTT)溶解,在4℃ 30 000 g離心15 min,取上清,改良Bradford法測(cè)定蛋白濃度。取100 μg蛋白使用FASP(filter-aided sample preparation)酶解方法進(jìn)行酶解[1],并將酶解肽段凍干。

將凍干的肽段用30 μL 0.5M TEAB進(jìn)行溶解,取出iTRAQ?Reagent-8Plex Multiplex Kit(Apple BioSosits),每組樣品對(duì)應(yīng)一個(gè)分子量。將標(biāo)記試劑離心,分別加入70 μL無(wú)水乙醇,震蕩混勻后高速離心,然后加入到各自對(duì)應(yīng)的酶解液中,充分混勻離心,室溫靜置反應(yīng)2 h;然后將肽混合物通過(guò)真空離心合并和干燥?；旌系腎TRAQ標(biāo)記肽的混合物通過(guò)高pH反相色譜分離。

使用島津LC-20AB HPLC泵系統(tǒng)的高pH反相色譜法,將ITRAQ標(biāo)記的肽混合物用0.5 mL緩沖液A(20mM甲酸銨,2% ACN,pH值10)組合,并加載到Gemini NX 5U C18 110A 150×4.6 mm(Phenomenex,廣州,中國(guó))。將肽以1 mL/min的流速洗脫,緩沖劑A的梯度為10 min,5%～35%緩沖液B(20 mM甲酸銨,98% ACN,pH值10)15 min,35%～80%緩沖液3 min。通過(guò)測(cè)量214 nm的吸光度監(jiān)測(cè)洗脫,每1 min收集部分。根據(jù)峰型和時(shí)間共收取10個(gè)組分,真空離心濃縮(Rotation vacuum Christ RVC 2-25，德國(guó)，Christ公司)。

用50 μL RP-LC A相(5%ACN,0.1%甲酸)溶解,在2 000 g離心10 min,在每個(gè)部分中,肽的最終濃度平均為0.5 μg/μL。將8 μL上清液加載到Eksigent ekspert nanoLC 425系統(tǒng)(AB SISEX)上,將肽洗脫到分析C18柱(內(nèi)徑75 μm)內(nèi)。將樣品裝入3 μL/min 4 min,然后從8%～25% B(ACN,0.1% FA)開(kāi)始,在600 nL/min下運(yùn)行45 min梯度,隨后15 min線(xiàn)性梯度為80%,在80% B處維持5 min。

采用Triple TOF 6600(Applied Biosystem,USA)系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。使用2.4 kV的離子噴涂電壓,MS掃描范圍350～1 500 (m/z),累積時(shí)間0.25 s,MS/MS掃描范圍(m/z)100～1 500,掃描模式為HS高靈敏度模式,累積時(shí)間0.05 s,IDA采集模式,一個(gè)MS1圖譜最多選擇40個(gè)最強(qiáng)的母離子進(jìn)行串級(jí)掃描。動(dòng)態(tài)排除時(shí)間設(shè)為18 s,IDA Advanced參數(shù)設(shè)為“rolling collision energy (CE)” and “Adjust CE when using iTRAQ Reagent”[13]。

質(zhì)譜產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)wiff和scan文件通過(guò)ProteinPilot 5.0(AB Sciex)進(jìn)行定量分析。數(shù)據(jù)庫(kù)為uniprot下載的小鼠數(shù)據(jù)庫(kù)。搜索參數(shù)包括:樣本類(lèi)型=iTRAQ 8PLEX(肽標(biāo)記)，半胱氨酸烷基化=碘乙酰胺，消化=胰蛋白酶。采用矯正后P值分析作為鑒定標(biāo)準(zhǔn)。設(shè)定1.5倍的截?cái)?以確定上調(diào)和下調(diào)的蛋白質(zhì)。

6.組織mRNA檢測(cè)

取約50 mg液氮凍存組織用于提取總RNA,操作方法參照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)(美國(guó)，Invitrogen公司),經(jīng)NanoDrop 1000紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度后,取1 μg總RNA用于合成cDNA。試劑采用PrimeScriptTMRT試劑盒(RR037A,TAKARA公司),方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。接著,SYBR Premix Ex TaqTM II試劑盒(RR820A,TAKARA公司)用于熒光定量PCR,操作方法參照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)。PCR反應(yīng)體系包括10 μL SYBR混合液,0.4 μL上下游引物,引物序列為F-5’AGAAAATCAGTGATGG AAGAGAGG3’,R-5’CCAGCACAACCTACTGAGC3’,ROX參照染料,2 μL cDNA模板,6.8 μL H2O。反應(yīng)條件:95℃ 30 s預(yù)變性,95℃ 5 s,60℃40 s,40個(gè)循環(huán)。之后按儀器的默認(rèn)程序進(jìn)行溶解曲線(xiàn)。PCR反應(yīng)在ABI7500定量PCR儀(Applied Biosystems,USA)上進(jìn)行。mRNA定量采用相對(duì)定量法,結(jié)果按2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算。內(nèi)參采用GAPDH(中國(guó)，生工公司)。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)分析在R軟件進(jìn)行(版本號(hào):3.3.1),生存曲線(xiàn)分析采用survival和survminer包,繪制Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)觀察兩組生存曲線(xiàn),并用Log Rank法比較sepsis組與Sham組的生存曲線(xiàn)是否有差異。熱圖繪制采用pheatmap包,聚類(lèi)分析采用系統(tǒng)聚類(lèi)法。mRNA多組比較采用非參法,軟件包為“ggpubr”“ggsci”,qPCR值RQ值取自然對(duì)數(shù),組間比較Wilcoxon法比較,組內(nèi)比較采用Kruskal-Wallis法。

結(jié) 果

一、CLP小鼠一般情況分析

1.小鼠一般情況及生存曲線(xiàn)

共85只小鼠,67只行CLP手術(shù),18只為假手術(shù)組,假手術(shù)組僅行腹部切口與縫合,總體病死率約60%,膿毒癥組死亡50%的時(shí)間約為手術(shù)后28 h。小鼠術(shù)后30 min內(nèi)逐步清醒,爬動(dòng)。8 h膿毒癥逐漸明顯,C57BL/6小鼠明顯,行動(dòng)遲緩,目光呆滯,毛豎立,無(wú)光澤。呼吸窘迫,呼吸頻率明顯加快。死亡數(shù)量從12 h后逐漸開(kāi)始并增多,高峰在16～24 h,20 h后部分sepsis小鼠開(kāi)始進(jìn)食,此時(shí)仍不穩(wěn)定,還有膿毒癥小鼠死亡,32 h后,進(jìn)入康復(fù)期,不再發(fā)生死亡,72 h飲食、外觀、活動(dòng)已完全恢復(fù)正常。對(duì)兩組生存曲線(xiàn)整體比較的Log Rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示，膿毒癥組與假手術(shù)組生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。圖1。

圖1 生存曲線(xiàn)

2.CLP死亡小鼠病理情況

死亡小鼠進(jìn)行了病理觀察,小鼠肺組織肺泡毛細(xì)血管及肺間質(zhì)充血,間隔水腫,炎癥細(xì)侵潤(rùn),可見(jiàn)出血,微血栓形成和肺間質(zhì)水腫。肝臟部分肝細(xì)胞核固縮,肝細(xì)胞濁鐘,脂肪變性明顯。局部可見(jiàn)小片狀肝細(xì)胞壞死。腎臟可見(jiàn)中度腎小管上皮細(xì)胞損傷,部分細(xì)胞核凝固,甚至消失。

二、iTRAQ技術(shù)定量檢測(cè)不同時(shí)間CLP小鼠蛋白組表達(dá)差異。

本研究12個(gè)樣本,分兩個(gè)反應(yīng)進(jìn)行,每次反應(yīng)每組各加一個(gè)mix,兩組鑒定的蛋白數(shù)量分別為1 038和937個(gè)。質(zhì)譜產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)wiff和scan文件通過(guò)ProteinPilot 5.0(AB Sciex)進(jìn)行定量分析,通過(guò)檢索數(shù)據(jù)庫(kù)為uniprot下載的小鼠數(shù)據(jù)庫(kù),獲得蛋白的名稱(chēng)。蛋白表達(dá)具有時(shí)間和空間特異性,在兩個(gè)不同條件下,表達(dá)水平存在顯著差異的蛋白稱(chēng)之為差異表達(dá)蛋白(DEP)。差異表達(dá)分析得到的蛋白集合叫做差異表達(dá)蛋白集,使用 “A-vs-B”的方式命名。根據(jù)兩(組)樣品之間表達(dá)水平的相對(duì)高低,差異表達(dá)蛋白可以劃分為上調(diào)蛋白(up-regulated protein)和下調(diào)蛋白(down-regulated protein)。上調(diào)蛋白在樣品(組)A中的表達(dá)水平高于樣品(組)B中的表達(dá)水平;反之為下調(diào)基因。上調(diào)和下調(diào)是相對(duì)的,由所給A和B的順序決定在差異表達(dá)基因檢測(cè)過(guò)程中,將FoldChange>1.2且P-Value<0.05(方差分析)作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。差異倍數(shù)(Fold Change)表示兩樣品(組)間表達(dá)量的比值。上述差異蛋白在膿毒癥組和假手術(shù)組同時(shí)獲得鑒定并定量,并且三個(gè)時(shí)間項(xiàng)都有數(shù)據(jù)者納入本次研究,共獲得13個(gè)蛋白,兩組內(nèi)不同時(shí)間項(xiàng)的組間比較見(jiàn)表1,兩組間相同時(shí)間項(xiàng)的比較見(jiàn)表2。

表1 假手術(shù)組與膿毒癥組不同時(shí)項(xiàng)組間比較(sh,假手術(shù)組;se,膿毒癥組)

注：Apoa5為載脂蛋白A-V(Apolipoprotein A-V),SAA1為血清淀粉樣蛋白A-1(Serum amyloid A-1 protein),Itih4為α-胰蛋白酶抑制劑,重鏈4(Inter alpha-trypsin inhibitor, heavy chain 4),Ang為血管生成素(Angiogenin),Fstl1為卵泡抑素相關(guān)蛋白1(Follistatin-related protein 1),Itih3為α-胰蛋白酶抑制劑,重鏈3(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H3),Psmb9為蛋白酶體亞單位β9型(Proteasome subunit beta type 9),Lbp為脂多糖結(jié)合蛋白(Lipopolysaccharide-binding protein),SAA2為血清淀粉樣蛋白A-1(Serum amyloid A-2 protein),Igh-VJ558為免疫球蛋白重鏈(J558家族)[immunoglobulin heavy chain (J558 family)],SAA4為血清淀粉樣蛋白A-4(Serum amyloid A-4 protein),Pigr為聚合免疫球蛋白受體(Polymeric immunoglobulin receptor),Masp1為甘露聚糖結(jié)合凝集素絲氨酸蛋白酶1(Mannan-binding lectin serine protease 1)

注：Apoa5為載脂蛋白A-V(Apolipoprotein A-V),SAA1為血清淀粉樣蛋白A-1(Serum amyloid A-1 protein),Itih4為α-胰蛋白酶抑制劑,重鏈4(Inter alpha-trypsin inhibitor, heavy chain 4),Ang為血管生成素(Angiogenin),Fstl1為卵泡抑素相關(guān)蛋白1(Follistatin-related protein 1),Itih3為α-胰蛋白酶抑制劑,重鏈3(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H3),Psmb9為蛋白酶體亞單位β9型(Proteasome subunit beta type 9),Lbp為脂多糖結(jié)合蛋白(Lipopolysaccharide-binding protein),SAA2為血清淀粉樣蛋白A-1(Serum amyloid A-2 protein),Igh-VJ558為免疫球蛋白重鏈(J558家族)[immunoglobulin heavy chain (J558 family)],SAA4為血清淀粉樣蛋白A-4(Serum amyloid A-4 protein),Pigr為聚合免疫球蛋白受體(Polymeric immunoglobulin receptor),Masp1為甘露聚糖結(jié)合凝集素絲氨酸蛋白酶1(Mannan-binding lectin serine protease 1)

聚類(lèi)分析顯示,蛋白可以根據(jù)時(shí)間順序可劃分為三組(圖2),對(duì)比第一組蛋白和膿毒癥生存曲線(xiàn),發(fā)現(xiàn)該組蛋白在膿毒癥組8 h和32 h高表達(dá),而在假手術(shù)組中沒(méi)有升高,表明該組蛋白是膿毒癥特異的標(biāo)志蛋白,與膿毒癥小鼠死亡高峰時(shí)間完全匹配,當(dāng)小鼠渡過(guò)危險(xiǎn)期,該組蛋白在72 h也已經(jīng)恢復(fù)到和對(duì)照組相同水平。這組蛋白中SAA1和SAA2最為明顯,可以作為膿毒癥檢測(cè)和預(yù)后的生物標(biāo)志分子。另外兩組蛋白顯示假手術(shù)組和膿毒癥組趨勢(shì)相近。見(jiàn)圖3(每組選擇2個(gè)蛋白作為代表)。

圖2CLP小鼠模型血清蛋白聚類(lèi)熱圖。(橫坐標(biāo),重復(fù)樣本,sh代表假手術(shù)組,se代表膿毒癥組,第一個(gè)“—”后代表時(shí)間,第二個(gè)“—”代表重復(fù)樣本;縱坐標(biāo)為k-mean聚類(lèi)樹(shù)狀圖)

注：Apoa5為載脂蛋白A-V(Apolipoprotein A-V),Lbp為脂多糖結(jié)合蛋白(Lipopolysaccharide-binding protein),SAA1為血清淀粉樣蛋白A-1(Serum amyloid A-1 protein),SAA2為血清淀粉樣蛋白A-1(Serum amyloid A-2 protein),Itih3為α-胰蛋白酶抑制劑,重鏈3(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H3),Masp1為甘露聚糖結(jié)合凝集素絲氨酸蛋白酶1(Mannan-binding lectin serine protease 1),Itih4為α-胰蛋白酶抑制劑,重鏈4(Inter alpha-trypsin inhibitor, heavy chain 4),Ang為血管生成素(Angiogenin),Psmb9為蛋白酶體亞單位β9型(Proteasome subunit beta type 9),Pigr為聚合免疫球蛋白受體(Polymeric immunoglobulin receptor),SAA4為血清淀粉樣蛋白A-4(Serum amyloid A-4 protein),Fstl1為卵泡抑素相關(guān)蛋白1(Follistatin-related protein 1),Igh-VJ558為免疫球蛋白重鏈(J558家族)[immunoglobulin heavy chain (J558 family)]

三、CLP小鼠SAA1在不同組織中的表達(dá)

采用qPCR法檢測(cè)了CLP模型小鼠,三種組織的SAA1mRNA表達(dá),所有數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)取log處理,并采用非參數(shù)方法比較。結(jié)果如圖4顯示,正常情況下SAA1mRNA在各組織不表達(dá),在創(chuàng)傷后肝組織SAA1mRNA表達(dá)水平8 h已經(jīng)明顯增高,而且直到72 h膿毒癥組仍然高表達(dá),假手術(shù)組開(kāi)始下降。肝外組織則不同,肺組織膿毒癥組8 h明顯增高,而32 h達(dá)到峰值,72 h恢復(fù)到正常水平,假手術(shù)組肺組織SAA1mRNA表達(dá)水平保持不變。小腸組織SAA1mRNA表達(dá),膿毒癥組在32 h才有顯著增高,72 h又恢復(fù)正常,假手術(shù)組肺組織SAA1mRNA表達(dá)水平保持不變。由此可見(jiàn),肝臟是小鼠SAA1的主要合成場(chǎng)所,其表達(dá)水平可達(dá)肝外組織的近1 000倍。肝組織合成SAA1在創(chuàng)傷后開(kāi)始,假手術(shù)組與膿毒癥組同步升高,幅度相近,只在膿毒癥小鼠恢復(fù)期顯示出與假手術(shù)組的差異。肝外組織表達(dá)SAA1的表達(dá)特異性的與膿毒癥進(jìn)程同步,8 h顯著增高,峰值在32 h,與創(chuàng)傷無(wú)關(guān)。對(duì)比血清蛋白SAA1的蛋白水平和mRNA的組織表達(dá)數(shù)據(jù)可知,血清中檢測(cè)的SAA1蛋白可能來(lái)自于肝外組織,一是因?yàn)閷?duì)照假手術(shù)組血清中檢測(cè)不到SAA1蛋白水平隨創(chuàng)傷發(fā)生進(jìn)程的變化,但肝內(nèi)SAA1mRNA 8 h已經(jīng)表達(dá),而且逐步增高,量級(jí)很大。二是膿毒癥組和假手術(shù)組肝SAA1mRNA表達(dá)72 h仍然處于高位,膿毒癥組比32 h水平還顯著提高,但血清SAA1蛋白已經(jīng)恢復(fù)到正常水平。因此,不排除肝外組織生成的SAA1釋放入血，特別是肺組織。肝內(nèi)組織合成大量的SAA1,是以與HDL結(jié)合的方式進(jìn)入外周血，在膿毒下時(shí)可能也有部分脫離HDL以單體形式進(jìn)入外周血。

圖3 血清蛋白表達(dá)相對(duì)強(qiáng)度與膿毒癥進(jìn)程的關(guān)系

注：橫坐標(biāo)為時(shí)間,單位:h,縱坐標(biāo)為表達(dá)相對(duì)強(qiáng)度,所以相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化處理,1組(A,B),2組(C,D),3組(E,F);SAA1為血清淀粉樣蛋白A-1(Serum amyloid A-1 protein)，SAA2為血清淀粉樣蛋白A-1(Serum amyloid A-2 protein)，Ang為血管生成素(Angiogenin)，Itih4為α-胰蛋白酶抑制劑，重鏈4(Inter alpha-trypsin inhibitor, heavy chain 4 )，Igh-VJ558為免疫球蛋白重鏈(J558家族)[immunoglobulin heavy chain (J558 family)]，F(xiàn)stl1為卵泡抑素相關(guān)蛋白1(Follistatin-related protein 1 )

討 論

膿毒癥是創(chuàng)傷、手術(shù)后嚴(yán)重的并發(fā)癥,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,與感染和機(jī)體非特異性炎癥反應(yīng)密切相關(guān),目前還缺乏對(duì)膿毒癥特異性的診斷和監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志分子,本研究擬通過(guò)定量蛋白質(zhì)組學(xué)的方法,發(fā)現(xiàn)并鑒定重要的生物標(biāo)志分子,為膿毒癥診斷和預(yù)后提供重要的靶標(biāo)。結(jié)果顯示,CLP小鼠在膿毒癥發(fā)病進(jìn)程中,4 h后出現(xiàn)膿毒癥癥狀,8 h后開(kāi)始出現(xiàn)死亡,12～24 h是死亡發(fā)生的集中時(shí)間,24 h后死亡減少,50%死亡發(fā)生時(shí)間約為28 h,總死亡率約60%。對(duì)死亡小鼠進(jìn)行病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),肺,肝,腎組織都發(fā)生病變。

圖4 CLP小鼠組織SAA1 mRNA表達(dá)

同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ) 技術(shù)是由AB SCIEX公司研發(fā)的一種體外同種同位素標(biāo)記的相對(duì)與絕對(duì)定量技術(shù)[14]。該技術(shù)利用多種同位素試劑標(biāo)記蛋白多肽N末端或賴(lài)氨酸側(cè)鏈基團(tuán),經(jīng)高精度質(zhì)譜儀串聯(lián)分析,可同時(shí)比較多達(dá)8種樣品之間的蛋白表達(dá)量,是近年來(lái)定量蛋白質(zhì)組學(xué)常用的高通量篩選技術(shù)。筆者利用iTRAQ技術(shù)對(duì)血清蛋白質(zhì)組進(jìn)行定性定量分析,共鑒定到1 000余種血清蛋白,并通過(guò)篩選重點(diǎn)鑒定了13個(gè)在膿毒癥組和假手術(shù)組不同時(shí)間點(diǎn)上組內(nèi)變化和組間變化都非常顯著的血清蛋白。對(duì)上述血清蛋白聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn),以SAA 1和SAA 2為代表的一組蛋白,與膿毒癥的進(jìn)程密切相關(guān),而與對(duì)照假手術(shù)組無(wú)關(guān)。人類(lèi)SAA被視為一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白,SAA家族是包括SAA1,SAA2,SAA3,SAA4的一組基因,串聯(lián)定位于11號(hào)染色體[15],形成一個(gè)基因簇,其中SAA3為假基因,SAA1,SAA2被稱(chēng)為急性識(shí)相反應(yīng)SAA(A-SAA),SAA4認(rèn)為是構(gòu)成性表達(dá)的SAA(C-SAA)。SAA1,SAA2基因的結(jié)構(gòu)非常相似,只相差幾個(gè)堿基,一般認(rèn)為是基因復(fù)制的產(chǎn)物。小鼠SAA家族基因定位在7號(hào)染色體[16]。由于SAA(SAA1和SAA2)只相差少量堿基,其產(chǎn)物無(wú)論是在mRNA水平還是蛋白水平的檢測(cè)都難以區(qū)分,基于一般抗體的檢測(cè)方法和PCR的檢測(cè)方法檢測(cè)的都是二者的混合物[17]。本研究采用質(zhì)譜法,在蛋白水平能夠有效鑒定和區(qū)分SAA家族的每一種蛋白。同時(shí)質(zhì)譜法檢測(cè)的SAA是游離形態(tài)的單體，這一點(diǎn)與基于抗原抗體法的檢測(cè)方法有所不同(檢測(cè)的是SAA與HDL的復(fù)合物)。本研究qPCR法mRNA檢測(cè)的任然是二者的混合物,但根據(jù)本研究的結(jié)果可知,小鼠血清蛋白中SAA1和SAA2表達(dá)的量級(jí)和時(shí)項(xiàng)基本一致,以SAA統(tǒng)稱(chēng)并不影響其應(yīng)用價(jià)值。

SAA作為血清急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，發(fā)現(xiàn)較早,在炎癥、感染和創(chuàng)傷后升高[18]，其主要機(jī)制一直不夠清晰。研究認(rèn)為肝臟是產(chǎn)生SAA的主要組織,其他組織也可少量合成,合成后其在肝內(nèi)主要與HDL結(jié)合通過(guò)血液轉(zhuǎn)運(yùn)到肝外SAA[19]。目前尚不清楚有多少血清中SAA是肝臟合成的,以及血清中游離的SAA與HDL結(jié)合的SAA功能上有何不同[17]。目前認(rèn)為SAA具有多種功能,早期通過(guò)細(xì)胞因子或LPS通過(guò)TLR2激活細(xì)胞釋放SAA,進(jìn)一步刺激單核細(xì)胞[20],白細(xì)胞釋放更多炎癥因子和化學(xué)因子。低濃度SAA可作為某些化學(xué)信號(hào)分子如CCL2,CCL3,CCL8的招募信號(hào)[21-23],這些信號(hào)能夠誘導(dǎo)更多的白細(xì)胞到組織的炎癥位點(diǎn)放大炎癥效應(yīng)。同時(shí)，高濃度SAA可能針對(duì)革蘭陰性菌和病毒還有調(diào)理素作用[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠血清單體形態(tài)的SAA1和SAA2與膿毒癥進(jìn)程一致,與假手術(shù)無(wú)關(guān),進(jìn)一步對(duì)比肝和肝外組織SAA1mRNA的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)mRNA的表達(dá)膿毒癥組與假手術(shù)組呈正相關(guān),72 h仍高表達(dá),此時(shí)血清中已經(jīng)檢測(cè)不到SAA1和SAA2,說(shuō)明血清中的SAA是肝外組織產(chǎn)生的,肝內(nèi)組織產(chǎn)生大量的SAA功能上可能與組織損傷修復(fù)相關(guān)。

綜上所述,通過(guò)iTRAQ技術(shù),本研究發(fā)現(xiàn)一組與膿毒癥進(jìn)程特別是與死亡發(fā)生密切相關(guān)的蛋白,其中以急性時(shí)相反應(yīng)蛋白SAA1最有代表性,對(duì)膿毒癥的診斷和預(yù)后具有重要價(jià)值。