謝 婷，歐志兵，黃麗艷，張 健，金 坤，瞿小旺，劉文培，羅迪賢

(1南華大學(xué)附屬郴州醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所,2南華大學(xué)附屬郴州醫(yī)院肝膽外科,湖南郴州423000)

0 引言

糖皮質(zhì)激素具有強(qiáng)大的抗炎和免疫抑制作用,通過抑制促炎細(xì)胞因子、激活抗炎細(xì)胞因子以及趨化因子來(lái)影響免疫應(yīng)答,因而廣泛用于自身免疫性和炎癥性疾病治療。研究表明,糖皮質(zhì)激素可以調(diào)節(jié)影響先天免疫和適應(yīng)性免疫的各種免疫細(xì)胞的功能,但其介導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用機(jī)制仍未完全闡明。CD8T細(xì)胞即細(xì)胞毒性T細(xì)胞可通過誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡、分泌細(xì)胞因子抑制靶細(xì)胞或分泌穿孔素(perforin)和顆粒酶直接殺死靶細(xì)胞。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4(cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)、程序性死亡受體-1(programmed cell death 1,PD-1)、淋巴細(xì)胞活化基因3(lymphocyte activation gene 3,LAG-3)和T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白分子-3(T-cell immunoglobulin-and mucin-domain-containing molecule,Tim-3)是表達(dá)于T細(xì)胞表面的抑制性受體。在穩(wěn)態(tài)條件下,通過抑制性受體的信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)平衡共刺激受體的活性,確保免疫應(yīng)答正常啟動(dòng)并發(fā)揮作用,當(dāng)信號(hào)傳導(dǎo)失控時(shí)將導(dǎo)致惡性激活和自身免疫。T盒轉(zhuǎn)錄因子(T-box expression in T cells,T-bet)和脫中胚蛋白(eomesodermin,Eomes)協(xié)同調(diào)節(jié)CD8效應(yīng)性T細(xì)胞分化,調(diào)節(jié)功能性細(xì)胞因子γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)、顆粒酶 B(granzyme B,GzmB)、穿孔素(Perforin)的表達(dá),與記憶CD8 T細(xì)胞轉(zhuǎn)換與維持有關(guān)。 Eomes在大多數(shù)脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育過程起重要調(diào)節(jié)作用,慢性病毒感染期間,T-bet和Eomes的差異表達(dá)促進(jìn)了抗病毒CD8T細(xì)胞庫(kù)的協(xié)同維持。

本研究通過糖皮質(zhì)激素體外短期處理健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),探討其對(duì)CD8T細(xì)胞表型、功能的影響及可能作用機(jī)制,為糖皮質(zhì)激素在臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象 收集2017年11月至2018年8月無(wú)糖皮質(zhì)激素使用史的健康志愿者外周血,剔除感染如乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、人類免疫缺陷病、梅毒等感染性疾病樣本。該研究在南華大學(xué)附屬郴州市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)和志愿者知情同意下進(jìn)行。本次研究對(duì)象共32例,男28例,女4例,年齡為(32.09±5.306)歲。

1.1.2 主要試劑 以下試劑購(gòu)自eBioscience公司：兔抗人CCR7 PE 610(3D12)；鼠抗人CD3 APC-eFluor780(SK7)、CD8 PerCP-Cy5.5(RPA-T8)、CD38 APC(HIT2)、Perforin FITC(dG9)、LAG3 FITC(3DS223H)、PD-1 PE-eFluor 610(eBioJ105)、 T-bet PE-Cyanine7(eBio4B10)、 Eomes APC(WD1928)；Brefeldin A、Human TruStain FcX(Fc Receptor Blocking Solution)、Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set。鼠抗人CD8 BUV737(SK1)、CD45RA FITC(HI100)、HLA-DR PE(G46-6)、TNF-α PE-Cy7(MAb11)、IFN-γ PE-CF594(B27)、Granzyme B PE(GB11)、Annexin V PE、 7-AAD PE-Cyanine5、Fixation/Permeabilization Solution Kit等試劑購(gòu)自BD Biosciences公司。鼠抗人 Tim-3 PE(344823)購(gòu)自 R＆D。Dexamethasone、PMA、Ionomycin購(gòu)自 Sigam-Aldricha公司。1.1.3 儀器與軟件 MoFlo XDP流式細(xì)胞分選儀(Beckman公司)獲取并分析細(xì)胞、軟件FlowJo V10.0分析流式數(shù)據(jù)、軟件GraphPad Prism 7作圖。

1.2 方法

1.2.1 樣本處理與地塞米松刺激 收集健康自愿者外周血6～10 mL,將外周血(血 ∶淋巴細(xì)胞分離液＝2：1)沿管壁緩慢加入至含分離液的離心管中,2200 rpm離心22 min。離心后吸取中間單個(gè)核細(xì)胞層,加至含10 mL RPMI 1640洗液的15 mL離心管中,混勻后1800 rpm離心10 min,棄上清,加細(xì)胞凍存液凍存于液氮罐中備用。復(fù)蘇細(xì)胞過夜后,加1 mL含10%FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10/mL,同一樣本分兩孔,每孔100 μL接種于96孔平底板中。并用地塞米松(終濃度為10～10mol/L)或完全培養(yǎng)基按總體積 200 μL/孔處理,37℃、5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。

1.2.2 細(xì)胞表面染色 將刺激后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至96孔V底板中,Live/Dead 1∶1000稀釋至工作濃度后,100 μL/孔4℃ 避光染色30 min,以分析時(shí)排除死細(xì)胞。細(xì)胞表面染色前,25 μL/孔染含5%Human TruStain FcX抗體懸液,4℃ 避光染色5 min,按抗體最適濃度、根據(jù)不同panel配制總體積50 μL/孔抗體懸液染色 CD3、CD8、CD45RA、CCR7、CD38 、HLADR、LAG-3、CTLA-4等抗體,4℃ 避光染色30 min,含1%FBS的staining buffer洗滌三次后流式上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 胞內(nèi)細(xì)胞因子分泌檢測(cè) 地塞米松處理PBMCs三天后,需檢測(cè)胞內(nèi)細(xì)胞因子則將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至96孔U底板中,PMA(50 ng/mL)+Ionomycin(1 μg/mL)再刺激6 h,開始刺激1 h后每孔加Golgistop(工作濃度1∶1500)以阻斷細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子釋放至胞外。細(xì)胞表面染色后,staining buffer洗滌細(xì)胞3次,Fixation/Permeabilization solution 100 μL/孔混勻后 4℃ 避光孵育20 min,BD Biosciences洗液洗滌細(xì)胞2次。按50 μL/孔體系加 GzmB、Perforin、TNF-α、IFN-γ 抗體,4℃ 避光染色30min,staining buffer洗滌三次后流式上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄因子染色 表面染色后,Foxp3/Tran-scription Factor Staining Buffer按說(shuō)明書配至工作濃度,100 μL/孔室溫避光孵育40 min后,eBioscience洗液洗滌細(xì)胞2次,按50 μL/孔體系染色 Eomes、T-bet抗體,4℃ 避光染色30 min,staining buffer洗滌細(xì)胞3次后流式上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 細(xì)胞經(jīng)表面染色后,用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次后用1X binding buffer調(diào)整細(xì)胞濃度至2×10/mL,轉(zhuǎn)移50 μL/孔至96孔V底板中。每孔加入7-AAD、Annexin v抗體室溫避光孵育15 min。 加 200 μL/孔 1X binding buffer后 1 h 內(nèi)流式上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料用x ±s表示,兩組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn),P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 地塞米松體外短期處理顯著降低效應(yīng)性CD8T細(xì)胞比例，改變細(xì)胞亞群分布 為明確地塞米松對(duì)CD8T細(xì)胞的影響,本研究采用地塞米松(10～10mol/L)處理健康人PBMCs 3天,發(fā)現(xiàn)地塞米松(10～ 10mol/L)均減少 CD8T 細(xì)胞比例(圖1B),且呈劑量依賴。根據(jù)該結(jié)果,本實(shí)驗(yàn)后期均選擇10mol/L地塞米松作為處理濃度。我們進(jìn)一步檢測(cè)據(jù)CD45RA、CCR7的表達(dá)定義的CD8T細(xì)胞四個(gè)亞群(圖1A),發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,初始 T細(xì)胞比例顯著增加(＜0.001),而效應(yīng)T細(xì)胞比例顯著減少(＜0.001)(圖1C)。這些結(jié)果表明,地塞米松體外短期處理主要降低效應(yīng)性CD8T細(xì)胞比例。

圖1 地塞米松短期處理改變CD8+T細(xì)胞及其亞群分布

2.2 地塞米松體外抑制CD8T細(xì)胞活化，促進(jìn)效應(yīng)性T細(xì)胞晚期凋亡 為進(jìn)一步探討地塞米松體外短期處理對(duì)CD8T細(xì)胞的影響,我們檢測(cè)了CD8T細(xì)胞及其亞群在地塞米松短期處理后其活化與凋亡情況。研究發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比,地塞米松抑制CD8T細(xì)胞的活化(＝0.044)(圖2A),各個(gè)亞群的活化也相應(yīng)受到抑制(＝0.043、＝0.04、＝0.042、＝0.045)(圖2B)。地塞米松短期處理未見影響總的CD8T細(xì)胞凋亡(圖2C、D)。分析其亞群細(xì)胞凋亡情況,發(fā)現(xiàn)地塞米松處理主要促進(jìn)CD8效應(yīng)性T細(xì)胞、抑制初始T細(xì)胞亞群的晚期凋亡(＝0.032、＝0.033)(圖2E、F)。結(jié)合結(jié)果1,我們推測(cè)：地塞米松短期處理可能通過抑制效應(yīng)性T細(xì)胞活化、促進(jìn)其凋亡從而顯著下調(diào)效應(yīng)性T細(xì)胞比例。

A和B：地塞米松抑制CD8+T細(xì)胞及其亞群的活化(活化標(biāo)志：CD38+HLA-DR+)。C和E：早期凋亡情況。D和F：晚期凋亡情況(早期凋亡：Annexin V+7-AAD-；晚期凋亡：Annexin V+7-AAD+)。 藍(lán)色柱：Medium紅色柱：Dex。注*與Medium比較,P＜0.05

2.3 地塞米松體外短期處理促進(jìn)CD8T細(xì)胞耗竭

免疫抑制性受體如 PD-1、Tim-3、CTLA-4、LAG-3 等通常在T細(xì)胞活化后高表達(dá),負(fù)向調(diào)節(jié)T細(xì)胞過度活化,慢性感染或炎癥同樣上調(diào)免疫抑制性受體表達(dá),引起T細(xì)胞功能耗竭。本研究發(fā)現(xiàn)：地塞米松體外短期處理顯著上調(diào)CD8T細(xì)胞表面抑制性受PD-1和 Tim-3的表達(dá)(＝0.009、＝0.023)(圖 3A、B)；而LAG-3、CTLA-4比例有上升趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3C、D)。這些結(jié)果提示,地塞米松體外短期處理可能會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致T細(xì)胞功能受損。

A：LAG-3表達(dá)；B：PD-1表達(dá)情況；C：Tim-3表達(dá)情況；D：CTLA-4表達(dá)情況。藍(lán)色柱：Medium,紅色柱：Dex。注*與Medium比較,P＜0.05；**與Medium比較,P＜0.01

2.4 地塞米松體外短期處理顯著抑制CD8T細(xì)胞的功能 為進(jìn)一步確認(rèn)地塞米松處理對(duì)CD8T細(xì)胞功能的影響。將地塞米松短期處理過后的PBMCs,經(jīng)PMA加Ionomycin刺激6 h后流式抗體胞內(nèi)染色(圖4A、B),研究發(fā)現(xiàn)地塞米松處理組CD8T細(xì)胞功能性因子 Perforin、GzmB 表達(dá)及 IFN-γ、TNF-α 分泌顯著降低(＝0.08、＝0.001、＝0.05、＝0.022)(圖4C、D),這些結(jié)果顯示地塞米松體外短期處理抑制CD8T細(xì)胞功能。

A：典型流式圖(左圖),CD8+T細(xì)胞Perforin表達(dá)情況；B：GzmB表達(dá)情況；C：IFN-γ 表達(dá)情況；D：TNF-α 表達(dá)情況。 藍(lán)色柱：Medium,紅色柱：Dex。注*與Medium比較,P＜0.05；**與Medium比較,P＜0.01

2.5 地塞米松體外短期處理影響CD8T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá) 如圖3、4所示,地塞米松短期處理抑制CD8T細(xì)胞功能,加速其耗竭。CD8T細(xì)胞的功能及免疫抑制性受體的表達(dá)主要受核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子T-bet及Eomes表達(dá)的調(diào)控。與圖3和圖4所示結(jié)果一致,本研究將地塞米松短期處理過的PBMCs經(jīng)破核膜后流式抗體核內(nèi)染色(圖5A),發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,地塞米松處理顯著下調(diào)CD8T細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Eomes表達(dá)(＜0.001),T-bet的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖 5B),而 Eomes/T-bet的比值也呈顯著降低(＝0.005)(圖5C)。

A：典型流式圖；B：CD8+T細(xì)胞核內(nèi) T-bet及 Eomes頻數(shù)；C：Eomes/T-bet的比值。藍(lán)色柱：Medium,紅色柱：Dex。注**與Medium比較,P＜0.01,***與Medium比較,P＜0.001

3 討論

糖皮質(zhì)激素具有免疫抑制和抗炎作用,也有研究表明皮質(zhì)類激素可以增加免疫及炎癥反應(yīng)甚至增加適應(yīng)性免疫應(yīng)答。CD8T細(xì)胞是適應(yīng)性免疫應(yīng)答的重要參與者,通過細(xì)胞毒性如GzmB和Perforin介導(dǎo)非細(xì)胞毒性功能來(lái)影響靶細(xì)胞；也可以通過表達(dá)CD95L(Fas)以Fas-Fas L依賴性方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；或者直接分泌促炎細(xì)胞因子 IFN-γ、TNF-α 維持局部炎癥?；罨腡細(xì)胞上通常上調(diào)表達(dá)免疫抑制性受體：如CTLA-4上調(diào),在維持細(xì)胞內(nèi)免疫控制和外周耐受中發(fā)揮重要作用；LAG-3負(fù)調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化和增殖；Tim在過敏和自身免疫性疾病中發(fā)揮著新的作用；PD-1作為效應(yīng)T細(xì)胞應(yīng)答的負(fù)調(diào)節(jié)劑,防止過度活化效應(yīng)T細(xì)胞的免疫病理?yè)p傷。

本研究發(fā)現(xiàn)地塞米松體外短期處理PBMCs減少CD8T細(xì)胞比例,且呈劑量依賴。與體外激素處理初始 CD8T 細(xì)胞結(jié)果一致,Chen 等在小鼠模型上也有報(bào)道。進(jìn)一步檢測(cè)亞群發(fā)現(xiàn),效應(yīng)T細(xì)胞比例減少,而初始T細(xì)胞比例顯著增加。Giles等也報(bào)道地塞米松增加初始 T細(xì)胞,減少效應(yīng)記憶細(xì)胞的頻率。T細(xì)胞凋亡及活化在維持免疫穩(wěn)態(tài)中起重要作用,檢測(cè)地塞米松對(duì)CD8T細(xì)胞活化及凋亡的影響,發(fā)現(xiàn)CD8T細(xì)胞及其四個(gè)亞群上CD38HLADR細(xì)胞頻數(shù)均減少,初始T細(xì)胞晚期凋亡比例減少,而效應(yīng)T細(xì)胞晚期凋亡比例增加。提示地塞米松可抑制CD8T細(xì)胞及其亞群的活化,影響亞群間的凋亡比例從而改變CD8T細(xì)胞亞群間的分布。Carol等報(bào)道多發(fā)性硬化癥患者靜脈注射甲潑尼龍后激活的CD8T細(xì)胞比例減少。Yi等在小鼠模型上證實(shí)地塞米松處理可使胸腺細(xì)胞凋亡百分比增加。這些結(jié)果表明,地塞米松體外短期處理,主要通過抑制效應(yīng)性CD8T細(xì)胞的增殖和促進(jìn)其凋亡從而降低效應(yīng)性T細(xì)胞頻率,從而達(dá)到免疫抑制作用。

一方面,地塞米松體外短期處理通過減少效應(yīng)性T細(xì)胞數(shù)量；另一方面本研究發(fā)現(xiàn)地塞米松體外短期處理同時(shí)抑制T細(xì)胞功能。地塞米松處理后CD8T細(xì)胞上 PD-1和Tim-3表達(dá)顯著上調(diào),其與 Kailin Xing等報(bào)道,地塞米松以劑量依賴的方式增強(qiáng)激活T細(xì)胞上PD-1的表達(dá)研究一致。Fourcade等研究報(bào)道PD-1和 Tim-3上調(diào)將導(dǎo)致腫瘤特異性CD8T細(xì)胞功能失調(diào),抑制其活化,當(dāng)協(xié)同使用受體拮抗劑后,部分CD8T細(xì)胞數(shù)量及功能得以恢復(fù)。糖皮質(zhì)激素的免疫抑制作用在于調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄,并抑制細(xì)胞因子如IFN-γ、TNF-α、白介素2等分泌。本研究發(fā)現(xiàn)地塞米松處理后CD8T細(xì)胞功能性細(xì)胞因子 GzmB、Perforin、IFN-γ、TNF-α 比例均顯著減少,提示CD8T細(xì)胞功能受損。有研究表明：糖皮質(zhì)激素幾乎可完全阻斷GzmB的產(chǎn)生,體外顯著減少T細(xì)胞上 IFN-γ、自然殺傷細(xì)胞上 perforin的表達(dá)。進(jìn)一步檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子發(fā)現(xiàn)：地塞米松處理組CD8T細(xì)胞上T-bet無(wú)明顯變化,但Eomes頻率、Eomes/T-bet的比值顯著降低。提示地塞米松破壞Eomes與T-bet之間的轉(zhuǎn)錄平衡,許多研究報(bào)道炎性細(xì)胞因子可反向調(diào)節(jié)記憶CD8T細(xì)胞中T-bet和Eomes的表達(dá)水平。CD8細(xì)胞耗竭的幾種關(guān)鍵指標(biāo)為：抑制性受體 PD-1、LAG-3、Tim-3、CTLA-4 等高表達(dá)；共刺激受體CD278和OX40的表達(dá)降低；轉(zhuǎn)錄因子T-bet、Eomes等的差異表達(dá)。 由于激素受體在免疫細(xì)胞上普遍高表達(dá),本研究不能排除地塞米松處理增加其他免疫抑制性細(xì)胞如Treg,Tr1(本實(shí)驗(yàn)室前期已發(fā)表數(shù)據(jù)),從而間接抑制CD8 T細(xì)胞活化及功能的可能性。

綜上,地塞米松體外短期處理一方面可抑制效應(yīng)性CD8T細(xì)胞的分化,促進(jìn)凋亡,降低效應(yīng)性T細(xì)胞比率；另一方面抑制CD8T細(xì)胞功能促進(jìn)T細(xì)胞耗竭,從而發(fā)揮其免疫抑制作用。本研究初步揭示了地塞米松對(duì)外周血CD8T細(xì)胞的影響及可能的機(jī)制,這些研究結(jié)果將為糖皮質(zhì)激素在臨床應(yīng)用中,對(duì)免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)提供一定的理論參考。由于本研究為體外實(shí)驗(yàn),具有一定的研究局限性,下一步將有必要深入探討糖皮質(zhì)激素受體及其相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制的研究,并在不同的免疫性疾病條件下,探討激素對(duì)CD8T細(xì)胞免疫抑制的可能機(jī)制。