寇艷波，劉慶亞，張 波，湯仁仙，王玉剛 (徐州醫(yī)科大學(xué)江蘇省免疫與代謝重點實驗室,江蘇徐州221004)

0 引言

肥胖已成為全球流行性疾病。肥胖及其伴隨的各種并發(fā)癥,如高血脂、脂肪肝、Ⅱ型糖尿病、心血管疾病,甚至腫瘤等正嚴(yán)重威脅著人類生命健康［1－2］。肥胖發(fā)生的根本原因是能量攝入長期大于能量消耗,過多的能源物質(zhì)儲存于白色脂肪細(xì)胞中,造成成熟白色脂肪細(xì)胞的增生和肥大,最終引發(fā)肥胖［3］。機(jī)體中除了含有白色脂肪細(xì)胞外還含有另外兩種脂肪細(xì)胞：棕色脂肪細(xì)胞和米黃色脂肪細(xì)胞［4］。米黃色脂肪細(xì)胞主要存在于白色脂肪組織中,可與白色脂肪細(xì)胞來源于相同的前體細(xì)胞［5－6］。棕色脂肪細(xì)胞主要存在于棕色脂肪組織中。米黃色和棕色脂肪細(xì)胞均可高表達(dá)解偶聯(lián)蛋白1(ucoupling protein 1,Ucp1),將化學(xué)能轉(zhuǎn)變成熱能,是機(jī)體代謝的重要調(diào)控者。增加米黃色或棕色脂肪細(xì)胞的量,將增加機(jī)體能量的消耗,對于肥胖的發(fā)生具有重要的抑制作用。由于人體中棕色脂肪細(xì)胞只存在于嬰幼兒時期,因此,促進(jìn)米黃色脂肪細(xì)胞的含量將是防治肥胖的新手段［7］。

白色和米黃色脂肪細(xì)胞的形成均受轉(zhuǎn)錄因子Pparγ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma)的調(diào)控。脂肪前體細(xì)胞經(jīng)不同的環(huán)境因素刺激可在Pparγ其他關(guān)鍵調(diào)控因子的影響下表達(dá)不同的功能蛋白［8］。白色脂肪細(xì)胞高表達(dá)p-HSL(phosphorylated Hormone sensitive lipase)和Perilipin 1；米黃色脂肪細(xì)胞在關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Prdm16(PR domain containing 16)的參與調(diào)控下高表達(dá)Ucp1。兒茶素在我們?nèi)粘Ｊ秤玫氖澄锖退蟹植紡V泛,其中綠茶中含量非常高。綠茶素有提神清心、去脂減肥的功效,但其去脂減肥的作用機(jī)制尚不完全清楚。聯(lián)合利華曾通過臨床實驗證明兒茶素對減肥的作用,以普通飲料為對照,在不改變參與者正常生活習(xí)慣的情況下,連續(xù)飲用高兒茶素含量綠茶90天后,參與者們體質(zhì)量、腰圍和內(nèi)臟脂肪均明顯減少,表明兒茶素極有可能是綠茶具有減肥作用的關(guān)鍵物質(zhì)。研究［9］表明兒茶素能夠影響成熟脂肪細(xì)胞的形成,因此具有潛在的減肥作用。

為更全面地了解兒茶素影響脂肪細(xì)胞形成的機(jī)制,本實驗著重從兒茶素對脂肪前體細(xì)胞的增殖,對脂肪前體細(xì)胞向白色脂肪細(xì)胞的分化和對脂肪前體細(xì)胞向米黃色脂肪細(xì)胞分化的影響進(jìn)行了研究,現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 小鼠脂肪前體細(xì)胞系3T3-L1購自武漢大學(xué)細(xì)胞保藏中心。細(xì)胞誘導(dǎo)分化試劑包括IBMX(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)、地塞米松、吲哚美辛、羅格列酮、三碘代-L-甲狀腺原氨酸購自Sigma。小鼠胰島素購自Peprotech。油紅染料購自Sigma。白色脂肪細(xì)胞標(biāo)志性蛋白Pparγ、p-Hsl、Perilipin 1和米黃色脂肪細(xì)胞標(biāo)志性蛋白Ucp1(Uncoupling protein 1)、Prdm16抗體購自 Abcam,內(nèi)參 β-Actin抗體購自Abclonal。兒茶素購自生工生物工程有限公司。CCK-8試劑盒購自Dojindo。

1.2 方法

1.2.1 脂肪前體細(xì)胞系誘導(dǎo)分化 用加有10%胎牛血清以及100 U/mL的青霉素和0.1 mg/mL的鏈霉素的DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)高糖培養(yǎng)基,培養(yǎng)小鼠脂肪前體細(xì)胞3T3-L1至細(xì)胞匯合。更換新鮮培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)48 h使細(xì)胞接觸抑制。48 h后用無菌的PBS將細(xì)胞充分洗滌,換用新的含有白色脂肪細(xì)胞分化混合液(2 μg/mL地塞米松,0.5 mM IBMX,5 μg/mL胰島素)或米黃色脂肪細(xì)胞分化混合液(2 μg/mL地塞米松,0.5 mM IBMX,1 μM羅格列酮,1 nM三碘代-L-甲狀腺原氨酸,125 μM吲哚美辛,5 μg/mL胰島素)的培養(yǎng)基再次培養(yǎng)48 h,誘導(dǎo)分化。最后換用含有10 μg/mL胰島素(維持白色脂肪細(xì)胞分化)或5 μg/mL胰島素,1 μM羅格列酮,1 nM三碘代-L-甲狀腺原氨酸(維持米黃色脂肪細(xì)胞分化)的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞并隔日換液,于第8天左右完成脂肪前體細(xì)胞的分化。

1.2.2 油紅染色 用異丙醇配制0.5%的油紅母液(現(xiàn)用現(xiàn)配),溶液經(jīng)濾紙過濾后,按照油紅母液 ∶水(6∶4)的比例進(jìn)行稀釋,獲得油紅染色工作液。分化成熟的脂肪細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌2遍后,加入4%多聚甲醛固定10 min。固定后的細(xì)胞經(jīng)PBS漂洗后加入60%異丙醇浸洗2 min。棄掉異丙醇后,加入油紅工作液染色15 min。棄掉油紅染液后,細(xì)胞用60%的異丙醇再次洗滌至背景基本無色。顯微鏡觀察脂滴形成情況。

1.2.3 熒光定量PCR 收集分化前和分化后的3T3-L1細(xì)胞,提取RNA,取總RNA 1 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得總cDNA,以不同組的cDNA為模板利用Roche Light Cycler 480熒光定量PCR儀檢測米黃色脂肪細(xì)胞標(biāo)志性基因的轉(zhuǎn)錄情況,內(nèi)參為 β-actin,引物序列如下：β-actin：5′CGTTGACATCCGTAAAGACC 3′和 5′AACAGTCCGCCTAGAAGCA 3′；Ucp1：5′AGAGGTCGTGAAGGTCAGAATG 3′和 5′TGACATTTCTCATTAGATTAGGGGT 3′；Pparγ：5′TTCAAGGGTGCCAGTTTCG 3′和 5′CCATCTTTATTCATCAGGGAGG 3′；Prdm16：5′GAGATGCTGACGGATACAGAGGT 3′和5′GGCGAGGTTTTGGTCATCAC 3′。

1.2.4 Western blot 細(xì)胞經(jīng)含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解后,測定蛋白濃度。每孔上樣總蛋白30 μg進(jìn)行SDS-PAGE,轉(zhuǎn)印至PVDF膜后用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,用相應(yīng)一抗4℃孵育過夜,洗滌后二抗孵育1 h再次洗滌后分別檢測目的蛋白存在。

1.2.5 細(xì)胞增殖實驗 小鼠脂肪前體細(xì)胞3T3-L1經(jīng)血球板計數(shù)后,調(diào)整細(xì)胞濃度至2×103個/mL,分為四組(分別加入終濃度 0、25、50、100 μM 的兒茶素),接種到含有新鮮DMEM(高糖)完全培養(yǎng)基的96孔板中,每組12孔(3個孔為一個平行組),分別于0 h、24 h、36 h和48 h通過CCK-8試劑盒測定細(xì)胞的相對數(shù)量(按照操作手冊進(jìn)行)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用Graph Pad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,實驗數(shù)據(jù)采用x±s表示,兩組間比較采用t檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兒茶素抑制脂肪前體細(xì)胞3T3-L1增殖 為檢測兒茶素是否能夠影響脂肪前體細(xì)胞的增殖,本研究通過CCK-8實驗檢測了兒茶素對脂肪前體細(xì)胞生長的影響。3T3-L1經(jīng)胰酶消化后接種到含有不同濃度兒茶素的新鮮培養(yǎng)基中,每隔24 h觀察細(xì)胞形態(tài)并檢測細(xì)胞相對數(shù)量。如圖1A所示兒茶素能明顯抑制脂肪前體細(xì)胞的增殖,含有25 μM兒茶素的組別,3T3-L1最終生長量只達(dá)到對照組的55%左右；更高濃度的兒茶素幾乎完全抑制了細(xì)胞增殖。顯微鏡下觀察結(jié)果顯示,兒茶素并沒有影響細(xì)胞的正常形態(tài)(圖1B),雖然50 μM 和100 μM 的兒茶素幾乎完全抑制3T3-L1的增殖,但是并沒有出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)的異?；蚣?xì)胞懸浮的現(xiàn)象,暗示兒茶素可能并不會促進(jìn)3T3-L1凋亡或壞死。

2.2 兒茶素抑制脂肪前體細(xì)胞3T3-L1向白色脂肪細(xì)胞分化 為確定兒茶素是否能夠抑制白色脂肪細(xì)胞的形成,我們研究了兒茶素對脂肪前體細(xì)胞向白色脂肪細(xì)胞分化的影響。由于高濃度的兒茶素具有強(qiáng)烈的細(xì)胞生長抑制作用,因此選用25 μM的兒茶素干預(yù)脂肪前體細(xì)胞向白色脂肪細(xì)胞的分化。3T3-L1完成接觸抑制后,添加白色脂肪分化混合液的同時,加入25 μM的兒茶素,并使后期維持分化的過程中,培養(yǎng)基中始終含有25 μM的兒茶素。細(xì)胞分化完成后,首先通過油紅染色觀察脂滴的形成情況,兒茶素的干預(yù)明顯抑制了白色脂肪細(xì)胞中脂滴的累積(圖2A)。與之相對應(yīng)的是,Western blot結(jié)果表明,白色脂肪細(xì)胞標(biāo)志蛋白Perlipin 1及磷酸化的Hsl的表達(dá)均受到明顯抑制,并且調(diào)控白色脂肪細(xì)胞形成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子 Pparγ的表達(dá)也受到明顯抑制(圖2B),這與Lee等［10］的結(jié)果相一致。由此可知,兒茶素能夠抑制脂肪前體細(xì)胞向白色脂肪細(xì)胞分化。

圖2 兒茶素對白色脂肪細(xì)胞形成的影響

2.3 兒茶素不影響米黃色脂肪細(xì)胞的形成 為明確兒茶素是否能夠調(diào)控米黃色脂肪細(xì)胞的形成,我們檢測了兒茶素對脂肪前體細(xì)胞向米黃色脂肪細(xì)胞分化的影響。與白色脂肪細(xì)胞分化實驗相同,從刺激分化開始,始終保持培養(yǎng)基中含有25 μM兒茶素。油紅染色結(jié)果顯示兒茶素同樣可以抑制米黃色脂肪細(xì)胞中脂滴的累積(圖3A),雖然與白色脂肪細(xì)胞形成過程中結(jié)果類似,兒茶素輕微地抑制了Pparγ的表達(dá),但不同的是兒茶素并不影響調(diào)控米黃色脂肪細(xì)胞形成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Prdm16以及米黃色脂肪細(xì)胞功能蛋白Ucp1的表達(dá)(圖3B、C)。綜合以上結(jié)果可知,雖然兒茶素能夠抑制米黃色脂肪細(xì)胞中脂滴的形成,但其并不影響米黃色脂肪細(xì)胞將化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮艿纳飳W(xué)功能。

A：油紅染色檢測胞內(nèi)脂滴的形成；B：Western blot檢測米黃色脂肪細(xì)胞標(biāo)志蛋白的表達(dá)；C：熒光定量PCR檢測米黃色脂肪細(xì)胞標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)錄

3 討論

隨著人們物質(zhì)生活水平的不斷提高和生活方式的改變,肥胖人群比例日趨增加且愈發(fā)低齡化。其伴隨的各種并發(fā)癥正嚴(yán)重威脅著人類的身心健康［11］。肥胖發(fā)生的根本原因主要是能量攝入長期高于能量消耗,過多能源物質(zhì)儲存造成白色脂肪細(xì)胞的增生和肥大,導(dǎo)致機(jī)體肥胖體征。因此,減少成熟白色脂肪細(xì)胞的數(shù)量或減小它們的體積,對于肥胖的防治均是有效的方法。此外,增加機(jī)體能量消耗減少能源物質(zhì)的堆積也將是防止肥胖的有效手段。米黃色脂肪細(xì)胞高表達(dá)Ucp1,能將化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮?可消耗體內(nèi)儲存的能源物質(zhì),它們的增多能夠?qū)Ψ逝值陌l(fā)生起到重要的抑制作用。由此可知,不管是減少脂肪細(xì)胞的數(shù)目還是抑制脂肪前體細(xì)胞向白色脂肪細(xì)胞分化或者促進(jìn)脂肪前體細(xì)胞向米黃色脂肪細(xì)胞分化均是防治肥胖的有效方法。

兒茶素作為日常食物中廣泛存在的小分子物質(zhì),已被多次證明具有減肥的功效。已有研究［12］表明,兒茶素能夠抑制白色脂肪細(xì)胞的形成,因此能夠起到減肥的作用,本研究結(jié)果與之相符。添加25 μM的兒茶素后,脂肪前體細(xì)胞3T3-L1向白色脂肪細(xì)胞的分化受到明顯抑制,油紅染色顯示胞內(nèi)脂滴積累量明顯減少。同時經(jīng)CCK-8實驗檢測,兒茶素明顯抑制了脂肪前體細(xì)胞3T3-L1的增殖。由于脂肪細(xì)胞接觸抑制后,在刺激劑作用下重新進(jìn)入有絲分裂,經(jīng)克隆增殖后才進(jìn)行分化［13］。兒茶素對脂肪前體細(xì)胞增殖的抑制作用可能是其抑制3T3-L1向白色脂肪細(xì)胞分化的關(guān)鍵原因。然而,在后續(xù)我們檢測兒茶素對脂肪前體細(xì)胞向米黃色脂肪細(xì)胞分化的過程中,發(fā)現(xiàn)同樣濃度的兒茶素,雖然抑制了米黃色脂肪細(xì)胞中脂滴的形成,但并不影響米黃色脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Prdm16和關(guān)鍵功能蛋白Ucp1的表達(dá),說明兒茶素可能并不影響脂肪前體細(xì)胞向米黃色脂肪細(xì)胞的分化。這也暗示了,兒茶素對脂肪前體細(xì)胞增殖的抑制作用并不是其抑制脂肪前體細(xì)胞向白色脂肪細(xì)胞分化的主要原因。此外,本研究觀察到在脂肪前體細(xì)胞向白色脂肪細(xì)胞分化過程中兒茶素明顯抑制了Pparγ的表達(dá),而在向米黃色脂肪細(xì)胞分化過程中只有輕微的抑制作用,這可能與兩種分化過程受到的其它刺激因素不同有關(guān)。如米黃色脂肪形成過程中需要羅格列酮的存在,而恰有研究證明羅格列酮可以上調(diào)舌癌Tca8113細(xì)胞中Pparγ的表達(dá)。

兒茶素抑制脂肪前體細(xì)胞向白色脂肪細(xì)胞分化的研究較多。近年來,有研究［14］發(fā)現(xiàn)兒茶素能夠結(jié)合67LR(67 kDa laminin receptor),進(jìn)而影響3T3-L1中脂多糖引起的TLR4(toll-like receptor 4)的活化,67LR可能是兒茶素抑制脂肪前體細(xì)胞向白色脂肪細(xì)胞分化的直接受體。也有研究［15］表明兒茶素可以通過結(jié)合脂筏,擾亂脂筏的正常功能而抑制脂肪前體細(xì)胞向米黃色脂肪細(xì)胞的分化。兒茶素的干預(yù)也影響了參與脂肪細(xì)胞分化的多條信號通路的改變,如PI3K-AKT、MEK/ERK、AMPK 等,這些信號途徑的改變進(jìn)一步影響下游調(diào)控脂肪細(xì)胞分化的細(xì)胞因子的表達(dá),最終決定脂肪前體細(xì)胞的分化命運［16］。兒茶素抑制米黃色脂肪細(xì)胞形成過程中脂滴的形成,但不影響米黃色脂肪細(xì)胞中Prdm16和Ucp1的表達(dá),可能跟這兩個過程分別受不同信號通路調(diào)控有關(guān)。

本研究結(jié)果證明兒茶素能夠抑制脂肪前體細(xì)胞增殖,因此能夠一定程度上減少脂肪前體細(xì)胞的數(shù)量,進(jìn)而減少引起肥胖的成熟白色脂肪細(xì)胞的數(shù)量；兒茶素還能夠抑制脂肪細(xì)胞中脂滴的形成,抑制脂肪前體細(xì)胞向白色脂肪細(xì)胞的分化,可進(jìn)一步減少成熟白色脂肪細(xì)胞的數(shù)量；此外,兒茶素并不影響脂肪前體細(xì)胞向米黃色脂肪細(xì)胞的分化,不影響米黃色脂肪細(xì)胞對儲存的能源物質(zhì)的消耗。總體來講,兒茶素可以在不抑制米黃色脂肪細(xì)胞能量消耗的情況下減少成熟白色脂肪細(xì)胞的數(shù)量,極有可能是兒茶素去脂減肥的關(guān)鍵原因。