李雪靜，唐強，葉濤，朱路文，吳佳佳，尹俠，秦萍，趙曉倩

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱市150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱市150001；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海市201203

腦卒中是單病種致殘率最高的疾病，其中以缺血性腦卒中發(fā)病率最高，且發(fā)病趨勢愈加年輕化。近20年來心肌梗死的發(fā)病率已經(jīng)下降3%～5%，而腦卒中的發(fā)病率卻上升50%[1]，嚴(yán)重影響人類健康和生活。

通過預(yù)處理的方式誘發(fā)腦缺血耐受，從而在損傷來臨時起到保護作用，這一方法為缺血性卒中的防治提供了啟發(fā)[2]。臨床上可以作為預(yù)處理的手段很多，如缺血、淺低溫、高壓氧、化學(xué)藥物、睡眠奪獲、皮質(zhì)擴散抑制等。電針作為臨床治療的常用且有效的手段，其腦保護作用受到越來越多的重視，并應(yīng)用于臨床及圍手術(shù)期。電針預(yù)處理可以明顯抑制自噬，減少凋亡，改善再灌注后的神經(jīng)功能損傷[3]。Li等[4]證實p53蛋白以及相關(guān)信號通路參與調(diào)節(jié)腦缺血再灌注損傷時細(xì)胞的自噬及凋亡。

本實驗通過觀察電針預(yù)處理對模型大鼠腦缺血再灌注損傷區(qū)域p-p53(ser392)、p53、微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3)Ⅱ蛋白的表達情況，探討其腦保護的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗用清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠72只，體質(zhì)量220～240 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，許可證號SCXK-黑-2010007。飼養(yǎng)環(huán)境：室內(nèi)溫度24～26℃；空氣濕度60%～70%、環(huán)境噪音＜60 dB，明暗各12 h交替(7:00～19:00開燈)。

1.2 主要儀器和試劑

G6805-1A型電針儀：上海華誼醫(yī)用儀器有限公司。DYCZ-24DN型蛋白凝膠電泳儀、DYCZ-40D型轉(zhuǎn)印電泳儀：北京六一儀器廠。RM2235型切片機：德國LEICA公司。Peri Flux 5000型激光多普勒血流儀：瑞典PERIMED公司。TUNEL試劑盒：德國ROCHE公司。一次性無菌針灸針：東邦牌。

p53、LC3、β-actin抗體：沈陽WANLEIBIO公司。p-p53(ser392)：英國ABCAM公司。四甲基乙二胺(N,N,N',N'-tetrameth-ylethylene-diamine,TEMED)：美國AMRESCO公司。羊抗兔IgG-HRP：中國BEYOTIME公司。預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)：加拿大FERMENTAS公司。PVDF膜：美國MILLIPORE公司。

1.3 動物分組及干預(yù)

編號設(shè)置：將72只實驗大鼠編號，計算機生成包括72個數(shù)的隨機數(shù)字表，列表中的第一個數(shù)字即為1號(對應(yīng)大鼠號碼)，按照從左到右，自上而下的順序分別編號1～72號大鼠。

組別設(shè)置：從列表中任意挑選一隨機數(shù)字除以3，余數(shù)為0、1、2分別對應(yīng)假手術(shù)組、模型組、電針預(yù)處理組，最終各組隨機分入24只大鼠。用同樣方法將各組24只大鼠隨機分入2 h、72 h兩個亞型組，每組12只。

假手術(shù)組大鼠與電針預(yù)處理組干預(yù)方法基本相同，但在造模時僅切開皮膚，剝離動脈，然后縫合；模型組進行大腦中動脈梗死造模，但無預(yù)處理措施；電針預(yù)處理組在進行預(yù)處理措施(電針)2周后進行造模。

1.3.1 電針預(yù)處理

固定大鼠，根據(jù)《實驗動物圖譜》選取大鼠百會穴(雙耳前緣連線中點)，采用1寸東邦針灸針(直徑0.25 mm，長25 mm)以45°進針深約2 mm，連接電針儀(一端連接針，另一端連接大鼠耳尖)，頻率2/15 Hz，強度1 mA，疏密波，以耳尖微動而無明顯躁動為準(zhǔn)，時間30 min，每天1次，每周5 d，共2周。

1.3.2 模型制備

術(shù)前12 h禁食，不禁水。10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，仰臥固定于恒溫加熱板。用碘伏將大鼠頸部環(huán)形消毒，頸正中切口，鈍性剝離各層組織，暴露各動脈，結(jié)扎頸總動脈、頸外動脈，于頸總動脈分叉處的下方剪一“V”型切口，插線栓，深度大致為距離分叉處約16～17 mm。查看大腦中動脈腦血流基線值，如果在30%以下則視為造模成功。結(jié)扎頸內(nèi)動脈，留出適當(dāng)長度線栓以備造模后2 h拔除所用。

假手術(shù)組不結(jié)扎和插栓，僅切開后予以縫合。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 神經(jīng)行為學(xué)評估

分別于再灌注后2 h、72 h采用改良神經(jīng)功能缺損評分(modified Neurological Severity Score,mNSS)對所有大鼠進行神經(jīng)行為學(xué)評估?？偡?4分，輕度損傷1～4分，中度損傷5～9分，重度損傷10～14分。

1.4.2 取材

所有大鼠神經(jīng)行為學(xué)評估后，分別于再灌注后2 h、72 h從各組抽取6只大鼠做心臟灌注：10%水合氯醛5.0 ml/kg腹腔注射深度麻醉大鼠后暴露心臟，以灌注針從心尖快速灌注生理鹽水100 ml，后繼續(xù)灌注4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液200 ml直至大鼠軀干發(fā)硬。斷頭取腦組織，以視交叉處為切開點將腦組織冠狀切開，向后取約6 mm，常規(guī)處理后制備5μm薄片，貼片后留存。

1.4.3 HE染色

石蠟切片60℃烘烤2 h，二甲苯脫蠟，下行梯度乙醇溶液水合，蒸餾水浸泡2 min，蘇木素浸泡5 min，蒸餾水浸泡5 min，1%鹽酸酒精分化3 s，自來水洗20 min，蒸餾水浸泡2 min，伊紅染液浸泡3 min。上行梯度乙醇溶液脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下拍照觀察。

1.4.4 TUNEL染色

取上述石蠟切片，常規(guī)處理后行連續(xù)冠狀切片，厚3～5μm，烤片后保存。烤片、脫蠟、水合、PBS漂洗；滴加TUNEL反應(yīng)液約50μl，孵育1 h，PBS漂洗；滴加POD反應(yīng)液約50μl，孵育30 min，PBS漂洗；顯色、PBS漂洗、染色，溫水返藍(lán)。脫水、透明、封片、鏡檢。每只大鼠取1張切片，低倍鏡(10×10)下定位腦梗死灶周邊頂葉皮質(zhì)區(qū)，高倍鏡(10×40)下觀察不重疊3個視野并采圖，采用Image Pro Plus 6.0對TUNEL陽性細(xì)胞進行計數(shù)，以3個視野下的均值作為該樣本凋亡細(xì)胞數(shù)。

1.4.5 Western blotting

再灌注后2 h、72 h，神經(jīng)行為學(xué)評估后，各組抽取6只大鼠，10%水合氯醛5.0 ml/kg腹腔注射深度麻醉大鼠。麻醉大鼠斷頭取腦后切取缺血側(cè)腦組織，放入液氮中凍存，留待Western blotting檢測。

取梗死區(qū)周邊腦組織40 mg，加入裂解液，離心機將腦組織離心，提取蛋白質(zhì)。0.5μg/μl BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)液配以PBS緩沖液至酶標(biāo)板，每孔20μl，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣本蛋白濃度。將待測樣本蛋白抽提物1μl與PBS緩沖液19μl混勻制備蛋白質(zhì)待測液。調(diào)至最大電流，在80 V電壓下，進行恒壓電泳2.5 h。轉(zhuǎn)印1.5 h、封閉，搖床進行慢速搖動約1 h。加入p-p53(1∶1000)、p53(1∶500)、LC3(1∶500)一抗，4 ℃孵育過夜，拿出PVDF膜，TTBS反復(fù)沖洗4次，每次持續(xù)5 min；加入羊抗兔IgG-HRP二抗(1∶5000)，37℃孵育45 min。加入ECL發(fā)光液，進行ECL底物發(fā)光，靜置5 min，曝光。內(nèi)參β-action稀釋比1∶1000，檢測過程同一抗。掃描膠片，采用Quantity One進行半定量分析，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參β-action蛋白灰度值比值為該蛋白的相對表達量，隨機選定假手術(shù)組某一樣本蛋白相對表達量為1，余樣本均為與其較正后的相對表達量，各組平行檢測6個樣本，求得各組目的蛋白平均表達水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計處理。計量資料采用(xˉ±s)表示，三組間比較采用ANOVA方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢測。顯著性水平ɑ=0.05。

2 結(jié)果

2.1 mNSS評分

再灌注2 h、72 h后，假手術(shù)組無明顯神經(jīng)功能缺損。與假手術(shù)組相比，同一時間點模型組的mNSS評分均升高(P＜0.05)。與模型組比較，電針預(yù)處理組再灌注72 h mNSS評分降低(P＜0.05)。見表1。

2.2 HE染色

再灌注2 h、72 h，光鏡下假手術(shù)組神經(jīng)元形態(tài)正常，胞核大而規(guī)整，核膜、核仁清晰可見，微血管周圍間隙正常。與假手術(shù)組相比，模型組、電針預(yù)處理組正常神經(jīng)元數(shù)量減少，深染色神經(jīng)元數(shù)量較多，其中模型組神經(jīng)元變性更明顯，間質(zhì)水腫更嚴(yán)重。見圖1。

2.3 TUNEL染色

再灌注2 h、72 h，假手術(shù)組有少量的凋亡細(xì)胞，即細(xì)胞核內(nèi)可見到較為顯著的棕黃色顆?；蛘咝“咂?。模型組與假手術(shù)組相比，同一時間點凋亡細(xì)胞數(shù)目增加(P＜0.05)。電針預(yù)處理組與模型組相比，再灌注72 h凋亡細(xì)胞數(shù)減少(P＜0.05)。見表2、圖2。

2.4 Western blotting檢測

再灌注2 h、72 h，與假手術(shù)組比較，同一時間點模型組p-p53、p53、LC3Ⅱ蛋白表達均升高(P＜0.05)。與模型組比較，再灌注2 h電針預(yù)處理組p-p53、LC3Ⅱ蛋白表達均降低(P＜0.05)，p53表達無顯著性差異(P＞0.05)；再灌注72 h，電針預(yù)處理組p-p53、p53、LC3Ⅱ蛋白表達均降低(P＜0.05)。見表3、圖3、圖4。

圖1 再灌注2 h、72 h各組大鼠缺血側(cè)神經(jīng)元(HE染色，bar=50μm)

圖2 再灌注2 h、72 h各組大鼠TUNEL陽性細(xì)胞表達結(jié)果(TUNEL染色，bar=50μm)

表1 再灌注2 h、72 h各組mNSS評分

表2 再灌注2 h、72 h各組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)(/HD)

表3 再灌注2 h、72 h各組p-p53、p53、LC3Ⅱ蛋白水平(相對表達量)

圖3 再灌注2 h、72 h各組大鼠p-p53、p53蛋白表達

圖4 再灌注2 h、72 h各組大鼠LC3Ⅱ蛋白表達

3 討論

缺血性腦卒中再灌注時間與預(yù)后成正相關(guān)，再灌注每延長半小時，3個月良性預(yù)后率可能下降12%[5]。再灌注可以有效恢復(fù)腦組織血液供應(yīng)，是減少損傷和神經(jīng)功能缺損的重要措施，但在恢復(fù)過程中易引起離子動態(tài)平衡紊亂和腦能量障礙，從而啟動“瀑布式”級聯(lián)損傷反應(yīng)，造成腦組織再次損傷，即缺血再灌注損傷。

Janoffd等1964年提出缺血耐受的概念，隨后的30年時間內(nèi)人們相繼在心臟、腦、腎臟等器官中發(fā)現(xiàn)，短暫的一次或重復(fù)缺血后，可以增強器官對缺血的耐受能力，以應(yīng)對再次損傷，并將之稱為缺血預(yù)處理[6]。預(yù)處理可以歸結(jié)于中醫(yī)“治未病”范疇，體現(xiàn)了“預(yù)防為主”的醫(yī)學(xué)思想。其潛在的機制可能涉及興奮性或抑制性神經(jīng)遞質(zhì)、炎癥因子、腺苷、信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、DNA自我修復(fù)/重塑機制、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等[7-10]。在腦缺血之前給予電針刺激，誘導(dǎo)腦組織細(xì)胞對抗腦缺血缺氧而產(chǎn)生耐受，從而對隨后發(fā)生缺血的腦組織產(chǎn)生部分保護作用的處理措施，稱為電針預(yù)處理[11]。

電針是康復(fù)醫(yī)學(xué)科、針灸科、中醫(yī)科在臨床上治療疾病的常用手段。多項研究表明，電針預(yù)處理不僅可以有效減輕缺血再灌注損傷，在缺血發(fā)生后給予電針治療同樣能夠發(fā)揮保護作用[12]。以往的研究結(jié)果表明，常用于腦保護的穴位主要有百會、大椎、委中、腎腧及足三里等[13-15]。雖然這些穴位都具有一定的腦保護作用，但是中醫(yī)經(jīng)絡(luò)學(xué)理論表明，鄰近器官的穴位具有治療效果的特異性，且也有人應(yīng)用功能磁共振成像證明了鄰近選穴的優(yōu)勢[16]。

百會穴位于人體督脈之巔，位于軀體運動和感覺皮層的體表投射區(qū)，接近Wills環(huán)，臨床常用于預(yù)防和治療腦部疾病。我們前期進行的研究也表明，電針預(yù)處理百會穴可以有效減弱大腦缺血再灌注損傷后的炎性反應(yīng)發(fā)生，抑制壞死區(qū)域及周邊組織細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)腦缺血耐受的發(fā)生，具有神經(jīng)保護作用[17]。

腦缺血預(yù)處理的保護機制目前沒有全面闡明，現(xiàn)有的研究都表明該機制與許多復(fù)雜因素有關(guān)，其中細(xì)胞的凋亡和自噬是研究的熱點。凋亡發(fā)生的速度和凋亡神經(jīng)元的數(shù)量決定著缺血引起損害的范圍[18]。自噬本身是一種蛋白質(zhì)降解的代償機制(或防御機制)，可以加快細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)的循環(huán)，增強細(xì)胞對環(huán)境變化的耐受能力。二者功能不同，但又通過特定的條件相互關(guān)聯(lián)，在疾病發(fā)展的不同階段發(fā)揮各自作用，呈動態(tài)改變[19]。

p53是抑癌基因，組織缺氧、細(xì)胞損傷或癌細(xì)胞活化等應(yīng)激變化，均可誘導(dǎo)p53激活；被激活的p53蛋白通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，調(diào)控細(xì)胞分化和促進細(xì)胞凋亡等[20]。Sung等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，p53也參與機體缺血缺氧時自噬機制的調(diào)節(jié)。Kotulska等[22]發(fā)現(xiàn)缺血小鼠模型的海馬C1區(qū)域以及皮質(zhì)中的自噬表達增加，可明顯減輕損傷神經(jīng)元的壞死。但也有研究[23]發(fā)現(xiàn)，阻斷自噬后可以減少大鼠腦缺血的梗死范圍以及腦水腫嚴(yán)重程度。綜合來看，自噬應(yīng)該具有雙重作用，且和一種自噬標(biāo)志蛋白ATG8募集有關(guān)。當(dāng)機體面臨“可處理”的刺激時，ATG8會被募集到自噬泡中，促進自噬對受損細(xì)胞的修復(fù)；但當(dāng)這種不良刺激增大到“不可控”的損傷閾值時，細(xì)胞就進入凋亡通路[24]。p53蛋白同樣有雙面作用，因其胞內(nèi)的定位不同而作用不同。當(dāng)其出現(xiàn)在胞核內(nèi)時是促進自噬，而在胞質(zhì)中卻有相反作用，多與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)[25]。

本研究結(jié)果顯示，腦缺血再灌注72 h，TUNEL法觀察到凋亡細(xì)胞數(shù)多于再灌注2 h，說明急性再灌注期間細(xì)胞凋亡呈加重趨勢；LC3Ⅱ作為自噬標(biāo)志蛋白，于腦缺血再灌注2 h、72 h其表達呈升高趨勢；HE染色顯示，腦缺血再灌注72 h缺血側(cè)腦損傷程度明顯重于再灌注2 h，提示急性再灌注期間腦損傷程度的加重與細(xì)胞凋亡的增加、自噬的過度增強密切相關(guān)。電針預(yù)處理組大鼠于再灌注2 h、72 h，缺血側(cè)腦損傷程度明顯改善，缺血半暗區(qū)細(xì)胞凋亡數(shù)明顯降低，自噬水平降低，說明電針預(yù)處理可以誘導(dǎo)腦缺血耐受，抑制腦缺血再灌注期間細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)自噬水平，改善神經(jīng)功能缺損，發(fā)揮腦保護作用。再灌注2 h、72 h，模型組p-p53、p53表達明顯升高，說明p53蛋白參與急性腦缺血再灌注期間病理過程；電針預(yù)處理組p-p53、p53表達較模型組有下降趨勢，提示電針預(yù)處理可以調(diào)控p53蛋白參與電針預(yù)處理的腦保護過程。值得一提的是，再灌注2 h，電針預(yù)處理組p53蛋白水平較模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。既往研究顯示，胞核p53是mTOR的上游介導(dǎo)蛋白，可以抑制mTOR表達，減弱mTOR對自噬相關(guān)蛋白ULK-1、Beclin1、DRAM表達的抑制作用，增強自噬。胞質(zhì)p53可以抑制Bcl-2表達，促進細(xì)胞凋亡出現(xiàn)[26]。再灌注2 h，電針預(yù)處理組p53蛋白較模型組無明顯降低，究其原因可能與胞內(nèi)的不同定位p53蛋白作用不同及表達差異有關(guān)，具體的調(diào)控機制有待進一步闡明。

綜上所述，重復(fù)電針預(yù)處理百會穴可以改善大鼠急性腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能缺損，降低缺血側(cè)腦損傷程度，發(fā)揮腦保護作用，其機制可能與調(diào)控p53蛋白影響急性腦缺血再灌注期間自噬及凋亡有關(guān)。我們后期將考察電針預(yù)處理是如何通過p53/mTOR通路進行腦缺血再灌注損傷調(diào)節(jié)腦保護作用的具體機制。

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