韋 琮 智， 王 璐， 叢 新 奇， 葉 淑 紅

( 大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

銀杏多糖是銀杏中一種生物活性豐富的重要組成成分[1]，研究表明，它具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗衰老、抗腫瘤、降血糖等多種活性作用[2]，而這些活性作用與銀杏多糖的抗氧化性有著密切的聯(lián)系[3]。

某些植物內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生和宿主植株相同或相近生物活性的物質(zhì)，利用這一特點，可以從植物中篩選出特定的內(nèi)生菌，并通過發(fā)酵得到大量目的產(chǎn)物[4]。從健康的銀杏器官組織中可以篩選出產(chǎn)生與銀杏葉多糖結(jié)構(gòu)和功能相似的胞外多糖的內(nèi)生菌，通過發(fā)酵培養(yǎng)從而實現(xiàn)銀杏多糖的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)[5]，不僅避免了直接提取造成的銀杏植株資源枯竭，而且可以不受地理位置和季節(jié)氣候的限制進(jìn)行生產(chǎn)[6]。

本實驗所用菌種EndoGinYa6是從銀杏葉芽中分離，并經(jīng)過初步篩選后得到的，經(jīng)鑒定確認(rèn)其為球形賴氨酸芽孢桿菌，GenBank編號為KY565423.1。王爽[5]已對其胞外多糖發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，馬志揚[6]對其胞外多糖活性進(jìn)行了研究。本實驗通過研究其胞外多糖的抗氧化性，確定其抗氧化能力，以期為開發(fā)和利用天然抗氧化劑在醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

銀杏內(nèi)生菌EndoGinYa6，分離自大連工業(yè)大學(xué)校園內(nèi)銀杏樹，本實驗室保藏。培養(yǎng)基：蔗糖12%，酵母浸粉0.8%，氯化鈉0.5%，磷酸氫二鉀0.1%，氯化鉀0.1%，初始pH 7.5。

1.2 方 法

1.2.1 胞外多糖的提取

銀杏內(nèi)生菌EndoGinYa6經(jīng)發(fā)酵后于4 000 r/min 離心15 min去除菌體，取上清液濃縮至原體積的1/4，加入4倍體積的95%乙醇醇沉，冷凍干燥后，制成粗多糖備用。

1.2.2 胞外多糖的純化

1.2.2.1 脫蛋白及透析

粗多糖溶液用Sevage法脫蛋白，后經(jīng)透析袋(截留分子質(zhì)量為5 ku)自來水流水、蒸餾水分別透析48 h，離心去除不溶物，冷凍干燥。

1.2.2.2 DEAE-52纖維素柱層析

胞外多糖配制成30 mg/mL的溶液，上樣量3 mL，于DEAE-52離子交換柱(2.2 cm×25 cm)，0～0.5 mol/L NaCl梯度洗脫，體積流量1 mL/min，用苯酚-硫酸法測定總糖。單一峰組分經(jīng)濃縮、透析、冷凍干燥。

1.2.2.3 Sephadex G-100凝膠柱層析

胞外多糖用洗脫緩沖液配制成10 mg/mL的溶液，上樣量2 mL，于Sephadex G-100凝膠柱(1.6 cm×50 cm)，0.05 mol/L pH 7.6 Tris-HCl緩沖液洗脫。合并單一峰組分，濃縮、透析、冷凍干燥。

1.2.3 多糖抗氧化性測定

1.2.3.1 還原力的測定

取多糖樣液1.0 mL，加入0.2 mol/L、pH 6.6的磷酸鹽緩沖液2.5 mL，1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混勻后置于50 ℃保溫20 min，冷卻后加入10% TCA。搖勻后離心，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%的三氯化鐵溶液，搖勻，靜置10 min，于700 nm處測定吸光度[7]。以同濃度抗壞血酸作為陽性對照。

1.2.3.2 對DPPH·自由基的清除作用

取多糖樣液2.0 mL，加入0.04 mg/mL的DPPH·乙醇溶液2.0 mL，混勻后室溫下避光靜置30 min，于517 nm處測定吸光度(A)。無水乙醇代替樣品溶液的吸光度為空白(A0)，無水乙醇代替DPPH·溶液的吸光度為對照(A′)，以同濃度的抗壞血酸作為陽性對照[8]。樣品對DPPH自由基的清除率按照下式計算：

清除率=[1-(A-A′)/A0]×100%

取50 mmol/L、pH 8.2的Tris-HCl緩沖液4.5 mL，于25 ℃水浴中預(yù)熱20 min，加入0.1 mL 不同濃度的多糖溶液或抗壞血酸溶液，再加入25 ℃預(yù)溫的7 mmol/L鄰苯三酚溶液0.4 mL，混勻后于25 ℃水浴中反應(yīng)4 min，加入濃鹽酸終止反應(yīng)，于320 nm處測定吸光度(A1)。蒸餾水代替樣品溶液的吸光度為空白(A′0)，蒸餾水代替鄰苯三酚溶液的吸光度為對照(A′1)，以同濃度的抗壞血酸作為陽性對照[9]。樣品對超氧陰離子自由基的清除率按照下式計算：

清除率=[1-(A1-A′1)/A′0]×100%

1.2.3.4 對羥自由基(·OH)的清除作用

取多糖樣液1.0 mL，加入9 mmol/L FeSO4溶液1.0 mL，9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1.0 mL，8.8 mmol/L的H2O2反應(yīng)，混勻后于37 ℃ 水浴中反應(yīng)30 min，于510 nm處測定吸光度(A2)。蒸餾水代替樣品溶液的吸光度為空白(A″0)，蒸餾水代替過氧化氫溶液的吸光度為對照(A′2)，以同濃度的抗壞血酸作為陽性對照[10]。樣品對羥自由基的清除率按照下式計算：

清除率=[1-(A2-A′2)/A″0]×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 多糖的純化

2.1.1 脫蛋白及透析

粗多糖經(jīng)過脫蛋白、透析和乙醇沉淀等處理后，可以脫除大部分的蛋白質(zhì)、色素和其他小分子雜質(zhì)，但仍然會有少量的雜蛋白，且多糖組分可能是分子質(zhì)量大小不同、所帶電荷不同的多糖組分混合物，還需要進(jìn)一步分離純化處理，得到純度較高的單一組分多糖。

2.1.2 DEAE-52纖維素柱層析

透析后的多糖經(jīng)過陰離子交換劑DEAE-52纖維素柱層析，其洗脫曲線如圖1所示。胞外多糖被分離成4個峰，表明其至少含有4種多糖組分。首先被蒸餾水洗脫出來為中性多糖，NaCl溶液中的Cl-可以將與離子交換劑結(jié)合的多糖組分置換出來，不同離子強(qiáng)度的NaCl溶液可以將帶不同電荷數(shù)的多糖組分洗脫下來，該組分即為酸性多糖。由圖1可知，EPS1為中性多糖，EPS2、EPS3、EPS4為酸性多糖，且EPS2為酸性多糖的主要組分，因此收集EPS1和EPS2備用。

圖1 胞外多糖纖維素柱層析洗脫曲線

2.1.3 Sephadex G-100凝膠柱層析

EPS1和EPS2經(jīng)過Sephadex G-100凝膠柱層析，其洗脫曲線如圖2所示。凝膠柱層析可以將相對分子質(zhì)量不同或者聚合體不等的組分分離。由圖2可知，EPS1在洗脫體積為40～120 mL

(a) EPS1

(b) EPS2

圖2 EPS1和EPS2在Sephadex G-100凝膠柱的洗脫曲線

Fig.2 Purification of EPS1 and EPS2 by Sephadex G-100

出現(xiàn)單一的對稱峰EPS1-1，EPS2在洗脫體積為35～115 mL出現(xiàn)單一的對稱峰EPS2-1，這表明EPS1-1為相對分子質(zhì)量均一的中性多糖，EPS2-1為相對分子質(zhì)量均一的酸性多糖，經(jīng)苯酚-硫酸法測定，EPS1-1和EPS2-1的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為82.36%和78.23%，分別收集兩種組分備用。

2.2 多糖的抗氧化性

2.2.1 多糖總還原力測定

還原力是判斷物質(zhì)抗氧化性強(qiáng)弱的一個重要指標(biāo)，兩種多糖還原力的對比結(jié)果如表1所示。由表1可知，多糖質(zhì)量濃度對其還原力有較顯著的影響，還原力的大小隨著質(zhì)量濃度的增大而增大，而EPS2-1的還原力要高于EPS1-1，但總體來說兩種多糖與VC相比還原力一般。

表1 EPS和VC的還原力對比

2.2.2 對DPPH·自由基的清除效果

兩種多糖對DPPH·清除作用的結(jié)果如表2所示。兩種多糖對DPPH·的清除能力隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到0.1 mg/mL 時，EPS1-1和EPS2-1對DPPH·的清除率分別達(dá)到34%和48%。當(dāng)清除率達(dá)到50%時，所需的EPS1-1、EPS2-1和VC質(zhì)量濃度分別為0.139、0.107和0.024 mg/mL，可見兩種多糖對DPPH·黨政不分清除能力，且EPS2-1的清除能力要高于EPS1-1，但均弱于VC。

表2 EPS和VC對DPPH·的清除率對比

2.2.3 對超氧陰離子自由基的清除效果

表3 EPS和VC對的清除率對比

2.2.4 對羥自由基的清除效果

兩種多糖對羥自由基清除作用的結(jié)果如表4所示。兩種多糖對羥自由基清除能力相仿，在0～1.5 mg/mL范圍內(nèi)，EPS1-1的清除能力略高于EPS2-1，當(dāng)質(zhì)量濃度高于1.5 mg/mL時，EPS2-1的清除能力超過了EPS1-1，但相差不大。當(dāng)清除率達(dá)到50%時所需的EPS1-1、EPS2-1和VC質(zhì)量濃度分別為5.679、4.667和0.283 mg/mL，可見兩種多糖對羥自由基的清除能力均弱于VC。

表4 EPS和VC對·OH的清除率對比

兩種多糖的抗氧化性強(qiáng)弱順序為EPS2-1、EPS1-1，這可能是由于酸性多糖EPS2-1分子中含有的酸性基團(tuán)種類和數(shù)量比中性多糖EPS1-1多，而酸性基團(tuán)和中性基團(tuán)在自由基清除過程中得失電子的能力不同，從而導(dǎo)致其抗氧化性的差異；也有可能是由于兩種多糖的相對分子質(zhì)量大小存在差異，其大小會影響多糖的分子體積、溶解性和黏度等性質(zhì)，進(jìn)一步影響其活性位點，從而導(dǎo)致其抗氧化性的差異。確切的原因還需要進(jìn)一步對多糖的分子質(zhì)量、單糖組成及含量、官能團(tuán)及空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

3 結(jié) 論

本研究對從銀杏中篩選出來的內(nèi)生菌EndoGinYa6發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖進(jìn)行了提取和純化，得到了分子質(zhì)量單一的中性多糖EPS1-1和酸性多糖EPS2-1，并對其進(jìn)行了抗氧化性研究。結(jié)果表明，兩種多糖均有一定的還原力和清除自由基的能力，其中對DPPH·自由基的清除能力較強(qiáng)；與VC相比，3種物質(zhì)抗氧化能力強(qiáng)弱順序為VC、EPS2-1、EPS1-1。由許春雨等[10]的研究可知，與其他中藥葉類相比，銀杏葉多糖具有較好的抗氧化性。而本研究就是選擇能夠產(chǎn)生胞外多糖的銀杏內(nèi)生菌EndoGinYa6作為發(fā)酵菌種，通過研究其胞外多糖的抗氧化性，確定其抗氧化能力，為其替代銀杏葉多糖作為天然抗氧化劑在醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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