車 明 月， 穆 賢， 李 學(xué) 一， 張 齊， 叢 麗 娜， 牛 慶 昌， 李 成

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

自由基是機(jī)體正常代謝的產(chǎn)物，參與生物體的多種生化過程，如胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞生長、免疫、防御等[1-3]。過多的自由基可造成生物膜脂質(zhì)過氧化損傷，DNA/RNA/氨基酸氧化交聯(lián)，從而破壞其具有的結(jié)構(gòu)或功能[7]。直接補(bǔ)充外源性抗氧化酶(SOD、CAT)能有效幫助機(jī)體清除過多的活性氧，減輕或阻止氧化損傷[8-10]。

海參能很好地抵御氧化脅迫型環(huán)境帶來的氧化損傷，其超氧化物歧化酶(SOD1)是機(jī)體自身抗氧化損傷的重要組成部分[9-11]。研究海參種屬SOD1具有很高的開發(fā)前景和應(yīng)用價(jià)值；同時(shí)，作為遼寧省重要的海產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)物種，研究開發(fā)海參SOD1，可以很好地提高其經(jīng)濟(jì)附加值。實(shí)驗(yàn)利用體外重組表達(dá)的Aj-SOD1，并檢驗(yàn)其活性，以期為深入研究Aj-SOD1性質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 海參來源及處理

海參采購于大連新長興海參市場。在實(shí)驗(yàn)室條件下，對海參進(jìn)行饑餓處理3～5 d，清空腸組織。

1.1.2 菌種與試劑

大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)，本實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司；Protein markers，大連寶生物有限公司；Ni2+-NTA 親和層析填料，GE healthcare公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方 法

1.2.1 提取海參腸組織總RNA

采用Trizol法提取海參腸組織的總RNA。1.5%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證RNA提取情況。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈

參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明，以海參腸組織總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈。

以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，采用Aj-β-actin 特異性引物：P1-AGTATTTCCTCTCTCTGGTGGAGCG和P2-TCATCACCATTGGCAACGAAAGGT擴(kuò)增海參β-actin基因片段(278 bp)，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，檢測反轉(zhuǎn)錄后的結(jié)果。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s，擴(kuò)增30 cycles。

1.2.3 擴(kuò)增海參SOD1全長cDNA序列

以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，通過引物P3-ATGCTCTACAAGCCGTTTGCGTTT和P4-TTAGACCTGTTTGATACCAATGA，擴(kuò)增海參SOD1蛋白的全長編碼序列(459 bp)。PCR條件：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s，擴(kuò)增30 cycles。1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證結(jié)果。通過TA克隆構(gòu)建克隆質(zhì)粒pMD18-Aj-SOD1，測序驗(yàn)證。

1.2.4 構(gòu)建海參SOD1重組表達(dá)載體

以pMD18-Aj-SOD1為模板，通過引物P5-CATATGATGCTCTACAAGCCGTTTGCGTTT (NdeⅠ)和P6-CTCGAGTTAGACCTGTTTGATACCAATGA (XhoⅠ)，擴(kuò)增帶有酶切位點(diǎn)的SOD1基因片段，構(gòu)建克隆載體pMD18-Aj-SOD1 (XhoⅠ/NdeⅠ)。分別對其和表達(dá)載體pET30a進(jìn)行雙酶切，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET30a-Aj-SOD1，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。菌落PCR檢測陽性轉(zhuǎn)化子，并測序驗(yàn)證。

1.2.5 海參SOD1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-Aj-SOD1轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)宿主BL21(DE3)中，37 ℃、180 r/min過夜活化。按1%的接種量放大培養(yǎng)。當(dāng)菌液OD600在0.6～0.8，加入0.1 mmol IPTG、100 μmol/mL 的CuSO4和ZnCl2。誘導(dǎo)表達(dá)8 h后，SDS-PAGE電泳檢測海參SOD1蛋白的表達(dá)情況。

1.2.6 鄰苯三酚自氧化法檢測海參SOD1活性

以BL21(DE3)/pET30a空載體為陰性對照，根據(jù)吸光度的變化，利用紫外分光光度計(jì)在320 nm 處測定SOD1活性[12]，檢測條件見表1。

表1 海參SOD1活性的檢測條件

2 結(jié)果與討論

2.1 海參腸組織總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

利用Trizol法提取海參腸組織的總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，成功地從海參腸組織提取了總RNA，且其純度較高，無明顯降解和污染，完全符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 海參腸總RNA的提取

Fig.1 Extraction of total RNA from intestinal tissue ofApostichopusjaponicusdetected by agarose gel electrophoresis

以海參肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因，通過引物P1/P2，檢測反轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果表明，mRNA成功地反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

2.2 Aj-SOD1的擴(kuò)增及克隆載體的構(gòu)建

按照圖2中的方案，以cDNA為模板，根據(jù)Aj-SOD1上下游引物P3/P4，擴(kuò)增其全長CDS編碼序列。鑒定結(jié)果如圖3所示，在400～500 bp有一條明亮的單一條帶，為459 bp，通過TA連接構(gòu)建到克隆載體pMD18-T上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌。挑取的陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)過測序比對與NCBI數(shù)據(jù)庫上Aj-SOD1基因序列完全一致。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)成功地獲得了Aj-SOD1的全長編碼基因，并構(gòu)建了含有Aj-SOD1基因的克隆載體pMD18-Aj-SOD1。

圖2 克隆載體pMD18-Aj-SOD1的構(gòu)建

圖3 凝膠電泳檢測Aj-SOD1基因擴(kuò)增

2.3 Aj-SOD1表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化、篩選

根據(jù)方法“1.2.4”，在克隆載體pMD18-SOD1目的基因序列上下游引入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，獲得新的克隆載體pMD18-Aj-SOD1，方案如圖4所示。分別對克隆載體pMD18-Aj-SOD1和表達(dá)載體pET-30a(+)進(jìn)行雙酶切，獲得線性表達(dá)載體大片段和Aj-SOD1目的基因小片段，結(jié)果如圖5所示。

將獲得的基因片段和表達(dá)載體進(jìn)行T4連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET30a-Aj-SOD1。對陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR檢測，結(jié)果如圖6所示，在分子質(zhì)量約400～500 bp處出現(xiàn)明顯條帶。測序結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建海參超氧化物歧化酶重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-Aj-SOD1。

圖4 表達(dá)載體pET30a-Aj-SOD1構(gòu)建方案

M1，100 bp DNA marker；M2，1 kb DNA marker；1，pMD18-Aj-SOD1酶切前；2，pMD18-Aj-SOD1酶切后；3，pET30a(+)酶切前；4，pET30a(+)酶切后

圖5 pMD18-Aj-SOD1和pET30a(+)雙酶切結(jié)果

Fig.5 Double enzyme digestion of pMD18-Aj-SOD1 and pET30a(+) detected by gel electrophoresis

2.4 Aj-SOD1蛋白表達(dá)及誘導(dǎo)條件

構(gòu)建海參超氧化物歧化酶的原核表達(dá)系統(tǒng)BL21(DE3)/pET30a-Aj-SOD1。對其進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)海參超氧化物歧化酶目的蛋白。檢測結(jié)果如圖7所示，空載體無論是上清還是沉淀幾乎沒有Aj-SOD1蛋白表達(dá)，而基因工程菌BL21(DE3)/pET30a-Aj-SOD1上清與沉淀相比明顯在上清中的表達(dá)量更高，雜帶較少。與陰性對照菌株比較，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在15 ku附近出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶，與預(yù)測的Aj-SOD1的分子質(zhì)量為14.956 ku基本相符。

圖6 Aj-SOD1基因擴(kuò)增的結(jié)果檢測

M，標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker；1，空載BL21(DE3)/pET30a誘導(dǎo)8 h 后的破菌沉淀；2，空載BL21(DE3)/pET30a誘導(dǎo)8 h后的破菌上清；3，BL21(DE3)/pET30a-Aj-SOD1誘導(dǎo)8 h后的破菌沉淀；4，BL21(DE3)/pET30a-Aj-SOD1誘導(dǎo)8 h后的破菌上清

圖7 SDS-PAGE凝膠電泳檢測Aj-SOD1蛋白的表達(dá)

Fig.7 Aj-SOD1 expression result detected by SDS-PAGE

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，基因工程菌成功表達(dá)了可溶的仿刺參超氧化物歧化酶蛋白。蛋白表達(dá)條件為0.1 mmol/L IPTG、37 ℃、180 r/min條件下誘導(dǎo)8 h，體外成功獲得高表達(dá)、可溶性的海參蛋白SOD1。

2.5 海參SOD1抗氧化活性

圖8 鄰苯三酚法檢測海參SOD1蛋白的抗氧化性

Fig.8 Antioxidant activity of Aj-SOD1 protein determined by pyrogallol oxidation method

3 結(jié) 論

通過反轉(zhuǎn)錄體外獲得海參SOD1蛋白的基因編碼序列，經(jīng)酶切、連接成功構(gòu)建目的基因表達(dá)載體pET30a-Aj-SOD1。借助原核表達(dá)宿主BL21(DE3)，體外成功誘導(dǎo)表達(dá)了具有抗氧化活性的海參超氧化物歧化酶蛋白。

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