李秀梅，石 瑜，朱雅寧，袁雪濤，楊愛華，楊 穎

（天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，天津 300402）

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與橫向流動(dòng)試紙條法快速檢測雞貧血病毒的研究

李秀梅，石 瑜，朱雅寧，袁雪濤，楊愛華，楊 穎

（天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，天津 300402）

本研究將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）與橫向流動(dòng)試紙條技術(shù)（lateral flow dipstick，LFD）聯(lián)合應(yīng)用，針對(duì)雞貧血病毒Cux-1 VP2基因設(shè)計(jì)了4條特異性引物和1條異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的探針，并對(duì)其反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了一種快速、便捷的雞貧血病毒LAMP-LFD檢測方法。結(jié)果顯示，優(yōu)化后的擴(kuò)增溫度和時(shí)間為63℃反應(yīng)50 min，完成檢測全過程僅需80 min。該方法檢測靈敏度為10 fg，是利用外引物建立的PCR方法的100倍；可特異性地檢出雞貧血病毒；重復(fù)性、穩(wěn)定性好。對(duì)30份樣品的病毒分離鑒定和LAMP-LFD檢測表明，二者符合率為100%。本研究建立的LAMP-LFD方法能夠快速、特異地檢測雞貧血病毒，并且不需要其他輔助儀器，結(jié)果可直觀判斷，適合基層實(shí)驗(yàn)室、應(yīng)急檢測或現(xiàn)場監(jiān)測等使用。

雞貧血病毒；VP2基因；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；橫向流動(dòng)試紙條；檢測

雞貧血病毒（Chicken anemia virus，CAV） 感染引起的雞傳染性貧血，主要發(fā)生在2～3周齡的雛雞，病雞的造血器官和淋巴組織受損，出現(xiàn)再生障礙性貧血、全身淋巴組織萎縮和免疫抑制。CAV對(duì)養(yǎng)雞業(yè)危害嚴(yán)重，所造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大。自1979年Yuasa等[1]首次在日本分離到CAV后，英國、德國、澳大利亞、美國等許多國家相繼報(bào)道了CAV感染的發(fā)生。

1992年崔現(xiàn)蘭等[2]首次在我國分離到CAV，近年來各地又陸續(xù)報(bào)道有本病的發(fā)生，證實(shí)了國內(nèi)雞群中CAV感染較為普遍。目前CAV的實(shí)驗(yàn)室診斷主要采用病毒分離鑒定和PCR或?qū)崟r(shí)定量熒光PCR技術(shù)[3-9]，但這些方法操作繁瑣、耗時(shí)長，必須配備昂貴的儀器設(shè)備并且需要專門的操作人員。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）由Notomi等[10]2000年建立，該技術(shù)通過針對(duì)目的基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異性引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶（BstDNA polymerase），在等溫65℃左右?guī)资昼娂纯蓪?shí)現(xiàn)核酸的高效擴(kuò)增。2008年Kiatpathomchai[11]首次將橫向流動(dòng)試紙條技術(shù)（lateral flow dipstick，LFD）與環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相結(jié)合（LAMP-LFD），用于LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測。目前，該方法已被成功用于嗜鹽弧菌、人的非洲錐蟲病、副溶血霍亂弧菌、桃拉病毒、傳染性肌肉壞死病毒、對(duì)蝦白斑癥病毒等病原的檢測。在橫向流動(dòng)試紙條技術(shù)檢測反應(yīng)中，F(xiàn)ITC標(biāo)記的探針與生物素標(biāo)記的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物特異性雜交，并與膠體金標(biāo)記的抗FITC的抗體結(jié)合形成三元復(fù)合物，結(jié)合在橫向流動(dòng)試紙條具有生物素抗體的檢測線上；未雜交的FITC標(biāo)記探針與膠體金標(biāo)記的抗FITC的抗體形成不含生物素的兩元復(fù)合物，通過檢測線，結(jié)合在控制線上。這樣可以通過檢測帶是否顯色判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的有無。因此，LAMP-LFD方法安全、快速、高效且無設(shè)備及技術(shù)限制，具有其他技術(shù)無法替代的優(yōu)勢(shì)。

本研究根據(jù)雞貧血病毒重要的毒力因子VP2基因設(shè)計(jì)一套引物和探針，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立雞貧血病毒LAMP-LFD檢測方法，旨在將該方法應(yīng)用于食品中雞貧血病毒的檢測。

1 材料和方法

1.1 毒株及試劑 雞貧血病毒Cux-1由北京畜牧獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)；禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒（Reticuloendotheliosis virus，REV）、雞傳染性法氏囊病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）、J亞群禽白血病病毒（Avian leukosis virus subgroup J，ALV-J）、禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）、雞傳染性支氣管炎病毒（Avian Infectious bronchitis virus，IBV）、雞馬立克氏病病毒（Marek’s disease virus，MDV）、雞新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈(zèng)；BstDNA聚合酶、Taq酶、dNTP、10×buffer（Mg2+Free）緩沖液購自紐英倫生物技術(shù)（北京）有限公司；Betaine Solution（甜菜堿）、鈣黃綠素購自美國Sigma公司；MgCl2、DNA Marker購自天根生化科技（北京）有限公司；全血基因組DNA提取試劑盒、普通質(zhì)粒小提試劑盒購自杭州博日股份科技有限公司；橫向流動(dòng)試紙條檢測所用通用檢測試紙條購自Milenia Biotec GmbH(Milenia Genline HybriDetect by Milenia Biotec GmbH, Germany,http://www.milenia-biotec.de/)。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中登錄的VP2基因序列（M55918.1）設(shè)計(jì)用于LAMP擴(kuò)增的外引物CAV-F3/CAV-B3、內(nèi)引物CAV-FIP/CAV-BIP等4條特異性引物，同時(shí)合成1條CAV-HP探針，用于LFD的雜交試驗(yàn)（表1）。在內(nèi)引物CAV-FIP的5'端標(biāo)記生物素，在CAV-HP的5'端標(biāo)記FITC。以上引物和探針由寶生物工程（大連）有限公司合成。 其中，外引物CAV-F3、CAV-B3同時(shí)用作PCR擴(kuò)增的特異性引物，擴(kuò)增的預(yù)期片段大小約為196 bp。

1.3 雞貧血病毒DNA基因組的提取 按照全血基因組DNA提取試劑盒說明書提取雞貧血病毒基因組DNA。

1.4 LAMP擴(kuò)增條件的確立 以雞貧血病毒基因組Cux-1 DNA 2個(gè)濃度作為模板進(jìn)行擴(kuò)增條件的優(yōu)化（經(jīng)測定，較高模板濃度相當(dāng)于100 pg，較低模板濃度相當(dāng)于100 fg）。LAMP反應(yīng)體系為25 μL，包括1×buffer（Tris-HCl 20 mmol/L（pH 8.8）、MgS046.5 mmol/L、KCl 10 mmol/L、（NH4）2SO410 mmol/L、Triton X-100 0.1%）、甜菜堿1.6 mol/L、dNTPs 1.4 mmol/L、外引物CAV-F3和CAV-B3各0.2 μmol/L、內(nèi)引物CAV-FIP和CAV-BIP各1.6 μmol/L、BstDNA聚合酶 8 U、雞貧血病毒基因組DNA模板2 μL。陰性對(duì)照不加任何模板DNA。反應(yīng)混合物在一定溫度下溫育后，經(jīng)80℃熱激5 min終止反應(yīng)，利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物。分別在61℃、62℃、63℃、64℃和65℃條件下擴(kuò)增60 min，根據(jù)擴(kuò)增效果確定適宜的反應(yīng)溫度；分別以20、30、40、50和60 min為反應(yīng)時(shí)間，在63℃恒溫下進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增效果確定適宜的反應(yīng)時(shí)間。

表1 本文使用的引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.5 橫向流動(dòng)試紙條檢測 利用優(yōu)化后的LAMP反應(yīng)體系，使用經(jīng)生物素標(biāo)記內(nèi)引物（CAV-FIP）進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束時(shí)不經(jīng)過終止反應(yīng)，而在反應(yīng)體系中加入20 pmol/μL 的探針CAV-HP，63℃雜交5 min。雜交結(jié)束后，將8 μL雜交液加入到100 μL buffer 中混勻，將LFD試紙條浸入其中，反應(yīng)約5 min，肉眼觀察結(jié)果。

1.6 LAMP-LFD的特異性試驗(yàn) 選擇7株免疫抑制性病毒用于LAMP-LFD的特異性試驗(yàn)，除雞貧血病毒外，還包括REV、IBDV、ALV-J、AIV、IBV、MDV、NDV。以較高濃度的雞貧血病毒Cux-1基因組DNA作為模板（相當(dāng)于100 pg），利用優(yōu)化的LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物分別經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳和LFD檢測擴(kuò)增結(jié)果。

1.7 LAMP的靈敏度測定 使用全血基因組DNA提取試劑盒提取雞貧血病毒Cux-1基因組DNA（相當(dāng)于100 ng），然后對(duì)提取的基因組DNA進(jìn)行連續(xù)10倍梯度稀釋，并以此為模板，利用優(yōu)化的LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物分別經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳和LFD檢測擴(kuò)增結(jié)果。同時(shí)，在相同模板濃度下，以外引物CAV-F3和CAV-B3為特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL：TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.15 μL、dNTPs（2.5 mmol/μL）2μL、CAV-F3 （10 pmol/μL）1μL、CAV-B3（10 pmol/μL）1 μL、模板2 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸8 min。擴(kuò)增產(chǎn)物利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.8 LAMP-LFD 的重復(fù)性試驗(yàn) 將提取的雞貧血病毒Cux-1基因組DNA（相當(dāng)于100 ng），進(jìn)行10倍梯度稀釋至LAMP-LFD檢測的最低濃度，平行制備3個(gè)樣品，并以此為模板，利用優(yōu)化的LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，驗(yàn)證該方法的重復(fù)性。

1.9 樣品檢測 采用病毒分離鑒定方法和本研究所建立的LAMP-LFD方法分別對(duì)采自養(yǎng)殖場和屠宰場的30份樣品進(jìn)行檢測。將采集樣品按照1:2（V/V）加入滅菌的1×PBS（pH7.2）進(jìn)行研磨，再加入終濃度為100 U/mL的雙抗，37℃作用30 min，反復(fù)凍融4次，離心棄沉淀，上清加入50%（V/V）氯仿作用15 min，期間不停的搖晃，除去其他可能的囊膜病毒。70℃水浴處理5 min，離心后上清經(jīng)0.22μm濾膜過濾，-80℃保存?zhèn)溆?。將處理后的樣品接種到5×105個(gè)/mL MSB1細(xì)胞，無血清RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)1～2 h，然后換含血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)盲傳8代，期間傳代至第二代和第四代分別拍照觀察并收集培養(yǎng)上清和細(xì)胞，提取DNA進(jìn)行PCR鑒定。同時(shí)采集樣品提取DNA，用于LAMP-LFD擴(kuò)增。

2 結(jié)果

2.1 LAMP 擴(kuò)增條件的建立 以較低濃度基因組DNA（100 fg）為模板，選擇61℃、62℃、63℃、64℃和65℃ 5個(gè)不同的反應(yīng)溫度進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。結(jié)果顯示，在同樣的反應(yīng)體系下，63℃時(shí)條帶最為清晰明亮，因此確定LAMP反應(yīng)的最適合反應(yīng)溫度為63℃（圖1）。以較高濃度基因組DNA（100 pg）作為模板時(shí)，反應(yīng)20 min即可檢測到擴(kuò)增產(chǎn)物；反應(yīng)30 min擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度幾乎達(dá)到最高值；延長擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間，擴(kuò)增產(chǎn)物濃度不再出現(xiàn)明顯提高（圖2A）。以較低濃度基因組DNA（100 fg）作為模板時(shí)，反應(yīng)20 min未能檢測到明顯擴(kuò)增；反應(yīng)30 min可檢測到明顯擴(kuò)增；反應(yīng)40 min擴(kuò)增產(chǎn)物濃度不再出現(xiàn)明顯提高（圖2B）。為確保樣品檢測時(shí)，在較低模板濃度下仍盡可能地檢出病原，選擇LAMP擴(kuò)增的最佳反應(yīng)時(shí)間為50 min。

圖1 LAMP 反應(yīng)溫度的確立Fig.1 The establishment of LAMP reaction temperature

2.3 LAMP-LFD特異性試驗(yàn)結(jié)果 按優(yōu)化的LAMP反應(yīng)體系，換用生物素標(biāo)記的內(nèi)引物CAV-FIP進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，以雞貧血病毒基因組DNA為模板的反應(yīng)產(chǎn)物可出現(xiàn)特征性的梯狀條帶，以其他6株病毒基因組DNA為模板的反應(yīng)產(chǎn)物中未見明顯擴(kuò)增（圖3A）。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)LFD檢測發(fā)現(xiàn)，以雞貧血病毒基因組DNA為模板的反應(yīng)產(chǎn)物可使LFD試紙條的檢測線位置出現(xiàn)明顯的陽性條帶，以其他6株病毒基因組DNA為模板的反應(yīng)產(chǎn)物在試紙條的檢測線位置出現(xiàn)條帶（圖3B）。

圖2 LAMP反應(yīng)時(shí)間的確立Fig.2 The establishment of LAMP reaction time

2.3 LAMP-LFD的靈敏度測定 雞貧血病毒Cux-1基因組DNA按10倍梯度稀釋至100 ng、10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg和1 fg。以不同濃度的基因組DNA為模板進(jìn)行l(wèi)AMP-LFD。結(jié)果顯示，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測的最低模板濃度為10 fg（圖4A和圖4B）。而以同樣的模板進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，可檢測的最低模板濃度為1 pg（圖4C）。可見，LAMP-LFD方法的靈敏度是利用外引物CAV-F3、CAV-B3建立的PCR方法的100倍。

圖3 LAMP(A)和LAMP-LFD(B)特異性分析Fig.3 Speci fi city analysis of LAMP(A) and LAMPLFD(B)

2.4 LAMP-LFD的重復(fù)性分析 取3份雞貧血病毒Cux-1基因組DNA，按10倍梯度稀釋至最低檢測濃度（約為10 fg），以此為模板進(jìn)行LAMP-LFD擴(kuò)增，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳和LFD檢測均可獲得明顯的陽性結(jié)果（圖5），表明該方法可重復(fù)、穩(wěn)定性好。

圖4 LAMP(A)、LAMP-LFD(B)和PCR(C)檢測的靈敏度比較Fig.4 Sensitivity comparision of LAMP(A), LAMPLFD(B)and PCR(C)

2.5 樣品檢測結(jié)果 細(xì)菌分離培養(yǎng)方法檢測顯示，采自屠宰場的15份樣品均未檢出雞貧血病毒，采自養(yǎng)殖場的15份樣品中有2份檢出雞貧血病毒。利用LAMP-LFD檢測采自屠宰場的樣品，均未獲得特異性擴(kuò)增；對(duì)采自養(yǎng)殖場的樣品進(jìn)行檢測，在2份細(xì)菌分離檢出CAV的樣品中獲得特異性擴(kuò)增，其他13份樣品的檢測結(jié)果均為陰性，與細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果符合率為100%。

圖5 LAMP(A)和LAMP-LFD(B)的重復(fù)性試驗(yàn)Fig.5 Repeatability analysis test of LAMP(A) and LAMPLFD(B)

3 討論

LAMP反應(yīng)僅在恒溫條件下即可進(jìn)行，擴(kuò)增效率極高，通常1 h內(nèi)可完成對(duì)靶基因約1010擴(kuò)增[8]，特別適用于病原微生物的快速檢測。其擴(kuò)增結(jié)果可通過瓊脂糖凝膠電泳、目視檢測濁度、濁度儀檢測濁度、目視檢測熒光和LFD等方法來判定。由于LAMP反應(yīng)引物多、產(chǎn)物復(fù)雜，瓊脂糖凝膠電泳、目視檢測濁度、濁度儀檢測濁度、目視檢測熒光等判定方法并不能夠區(qū)分特異性和非特異性擴(kuò)增，當(dāng)模板含量較低時(shí)，上述方法在結(jié)果判斷時(shí)也存在主觀性較大的弊端[12]。另外目視檢測熒光判定方法中使用的一些染料對(duì)LAMP擴(kuò)增反應(yīng)會(huì)有一些負(fù)面作用，例如SYBR greeΙ可與擴(kuò)增產(chǎn)物核酸的小溝結(jié)合，影響擴(kuò)增產(chǎn)物的量。電泳檢測法擴(kuò)增產(chǎn)物的靈敏度雖比目視檢測熒光和目視檢測濁度約高10倍，但電泳檢測法易增加產(chǎn)物污染的機(jī)率。而 LFD對(duì)LAMP擴(kuò)增結(jié)果的判定則是依賴于序列之間的特異性雜交，避免了瓊脂糖凝膠電泳、目視檢測濁度、濁度儀檢測濁度、目視檢測熒光等判定方法中由非特異性擴(kuò)增造成的假陽性，在LAMP擴(kuò)增的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高了反應(yīng)的特異性。本研究建立的雞貧血病毒LAMPLFD檢測方法具有良好的靈敏度和特異性，該方法優(yōu)于吳煥榮[13]建立的LAMP反應(yīng)體系，與鄧顯文等[14]報(bào)道的檢測線相當(dāng)。因此，在雞貧血病毒感染初期，雞體內(nèi)菌含量較低時(shí)，即可采用LAMPLFD進(jìn)行檢測。該技術(shù)不需要特殊的儀器設(shè)備實(shí)驗(yàn)室條件，檢測快速、操作簡便、靈敏度更高，為雞貧血病毒的診斷防控提供了新的發(fā)展方向，有望成為常規(guī)簡易檢測手段，尤其適用于基層和現(xiàn)場檢測應(yīng)用。

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RAPID AND SENSITIVE DETECTION OF CHICKEN ANEMIA VIRUS BY LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION COMBINED WITH LATERAL-FLOW DIPSTICK

LI Xiu-mei, SHI Yu, ZHU Ya-ning, YUAN Xue-tao, YANG Ai-hua, YANG Ying

(Animal Disease Prevention and Control Center of Tianjin,Tianjin 300402,China)

In the present study, we established a rapid Chicken anemia virus (CAV) detection method by combining loop-mediated isothermal ampli fi cation (LAMP) with lateral fl ow dipstick (LFD) examination. The method utilized four speci fi c primers targeting CAV Cux-1 VP2 gene for LAMP and fl uorescein isothiocyanate (FITC)-labeled probe to speci fi cally hybrid to the biotin-labeled LAMP product for LFD examination. The optimized ampli fi cation temperature and time were 63℃ and 50 min, respectively and whole procedure time was only 80 min including sample process. The LAMP-LFD method developed in this study speci fi cally detected CAV and showed no reaction with other 6 immunosuppressive viruses. The detection sensitivity was 10 fg, i.e. 100-fold lower than that of conventional PCR using the outer primer set. This method had good repeatability and stability. The LAMP-LFD method was used to test 30 specimens and compared with virus isolation and identi fi cation method. As a result, both methods had 100% agreement. Overall, the LAMP-LFD method rapidly and speci fi cally detected CAV and did not required other auxiliary equipment, thus suitable for basic laboratory testing, emergency use and on-site monitoring.

Chicken anemia virus; VP2 gene; loop-mediated isothermal ampli fi cation; lateral fl ow dipstick test; detection

S852.659.2

A

1674-6422（2018）01-0025-07

2017-04-11

李秀梅，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

李秀梅，E-mail：76068135@qq.com