相 笑，張彥兵，石元元，李玉明，劉 珂，魏建超，邵東華，李蓓蓓，童光志，馬志永，邱亞峰

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

PRRSV N蛋白抗原肽的預(yù)測、合成以及針對該抗原肽抗體的制備和應(yīng)用

相 笑，張彥兵，石元元，李玉明，劉 珂，魏建超，邵東華，李蓓蓓，童光志，馬志永，邱亞峰

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

基于生物信息學(xué)、化學(xué)合成技術(shù)和免疫學(xué)技術(shù)，利用預(yù)測的抗原肽進(jìn)行抗體的制備已被廣泛地應(yīng)用。本研究探討了利用預(yù)測的抗原肽制備針對PRRSV N蛋白的特異性抗體。首先，利用生物學(xué)軟件對高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）N蛋白進(jìn)行抗原性預(yù)測，獲得一個位于蛋白N端16個氨基酸的候選抗原肽。通過BLAST比對，發(fā)現(xiàn)該抗原肽在不同北美型毒株中高度保守。其次，采用Fmoc固相法進(jìn)行抗原肽合成，并將合成的抗原肽通過MBS法偶聯(lián)到KLH載體蛋白上。隨后，將偶聯(lián)好的抗原肽與弗氏完全佐劑或不完全佐劑混合，免疫新西蘭大白兔，制備抗血清，并利用IgG親和層析的方法純化抗體。最后，利用ELISA、Western blot和間接免疫熒光法（indirect immuno fl uorescence assay，IFA）對抗體的特異性進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，利用偶聯(lián)好的抗原肽包被ELISA板，檢測抗體的滴度，純化抗體的滴度超過105；Western blot結(jié)果顯示，該抗體（1∶2000）可以特異地識別PRRSV感染的Marc145細(xì)胞中的N蛋白，重要的是該抗體可以與不同毒株反應(yīng)；IFA檢測顯示，該純化的抗體（1∶100）可以檢測PRRSV感染的細(xì)胞。因此，利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測的PRRSV N蛋白的抗原肽，能有效地應(yīng)用于抗PRRSV N蛋白抗體的制備，制備的抗體不僅為研究PRRSV N蛋白奠定基礎(chǔ)，而且為研究PRRSV與細(xì)胞相互作用提供了一個有效的工具。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；核衣殼蛋白；抗原肽；抗體

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）屬于套式病毒目（Nidovirales）、動脈炎病毒科（Arteriviridae）、動脈炎病毒屬（Arterivirus），為單股正鏈不分節(jié)段的RNA病毒[1]。PRRSV首先由荷蘭科學(xué)家分離得到，有囊膜，病毒粒子呈卵圓形或球形，為二十面體對稱結(jié)構(gòu)，直徑大小為48～83 nm[2]。病毒基因組全長為15.4 kb，包括至少10個開放閱讀框，分別為ORF1a、ORF1b、ORF2～ORF7[3,4]。ORF1a和ORF1b約占病毒基因組的80%，編碼病毒的各個非結(jié)構(gòu)蛋白，主要編碼病毒復(fù)制酶。ORF2-5編碼病毒囊膜糖蛋白；ORF6編碼非糖基化膜基質(zhì)蛋白，俗稱M蛋白[5]；ORF7編碼N蛋白（又稱核衣殼蛋白），理論分子量大小為13.8～15.0 kDa，具有一個糖基化位點，但非真正的糖基化蛋白。N蛋白是病毒粒子中含量最高的蛋白，約占病毒蛋白總量的20%～40%[6]。N蛋白可在PRRSV感染后最早誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，這對PRRSV的早期診斷具有重要意義[7,8]。

除了在PRRSV診斷上的價值外，N蛋白在研究PRRSV與宿主細(xì)胞相互作用方面也具有重要的意義，該蛋白常常作為檢測病毒感染的指示蛋白[9-11]。然而，目前用于檢測PRRSV N蛋白的商業(yè)化的抗體屈指可數(shù)：比如SDOW17A單克隆抗體可以購買獲得，但是該抗體僅能用于間接免疫熒光法（indirect immunofluorescence assay，IFA）檢測，無法用于Western blot（WB）檢測，這為PRRSV深入研究帶來諸多不便。為此很多學(xué)者自制抗PRRSV N蛋白的抗體[12,13]，主要利用原核表達(dá)等方法制備重組抗原，隨后進(jìn)行抗體的制備。雖然該方法可以獲得針對PRRSV N蛋白的抗體，但是在不同實驗室推廣使用時往往受到蛋白表達(dá)、純化等條件的限制，耗費(fèi)時間長，并且特異性不一定好。因此，尋找更加高效的方法應(yīng)用于抗體的制備顯得尤為必要。

本研究基于生物信息學(xué)、化學(xué)合成等技術(shù)，獲得用于抗體制備的PRRSV N蛋白抗原肽。隨后，通過免疫大白兔制備多抗血清，通過ELISA檢測、Western blot和IFA驗證多克隆抗體的特異性。結(jié)果顯示，利用合成的抗原肽制備的抗體，不僅可以用于ELISA和IFA分析，而且可以用于Western blot。因此，我們篩選出的抗原肽可以有效地用于針對PRRSV N蛋白的抗體的制備，為PRRSV感染的應(yīng)用研究和基礎(chǔ)研究提供了重要的工具。

1 材料與方法

1.1 毒株、載體、細(xì)胞以及主要試劑 HP-PRRSV（SY0608）毒株由本實驗室保存；CH1R和JX1R分別為PRRSV經(jīng)典毒株和高致病株的疫苗株，也由本實驗室保存；真核表達(dá)載體p3XFLAG-CMV-14購自Sigma公司；Flag14-GP7質(zhì)粒由本實驗室構(gòu)建保存；傳代細(xì)胞系293T和Marc-145分別購自中科院上海細(xì)胞庫和ATCC；脂質(zhì)體2000、Opti-MEM 購于Invitrogen公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG購自Abcam公司；ECL發(fā)光試劑盒購于Pierce公司；封片劑購自Sigma公司；蛋白Marker購自Thermo公司；DMEM培養(yǎng)基購買自Hyclone公司；胎牛血清（FBS）購自Biological Industries公司。

1.2 抗原肽預(yù)測、合成及偶聯(lián) 利用NovoFocusTM抗原預(yù)測軟件（NovoPro公司）對PRRSV核衣殼蛋白（蛋白序列為Uniprot_A8D906）進(jìn)行抗原預(yù)測，選取了位于PRRSV核衣殼蛋白N端40～56位氨基酸作為抗原多肽。為了便于多肽偶聯(lián)到KLH蛋白上，我們在抗原多肽的C端加上半胱氨酸，最終抗原多肽序列為：N-GPGKKNRKKNPEKPHFPC-C?？乖嚯挠杉獱柹捎肍moc固相法進(jìn)行合成，并經(jīng)高效液相色譜(HPLC)和質(zhì)譜(MS)進(jìn)行純化鑒定。

1.3 多克隆抗體的制備 為了驗證抗原肽的抗原性，利用偶聯(lián)的抗原免疫大白兔進(jìn)行多克隆抗體的制備。在免疫前1 d進(jìn)行兔的耳靜脈采血，用作ELISA檢測時的陰性血清。將偶聯(lián)好的抗原肽與弗氏完全佐劑乳化后，皮下多點免疫新西蘭大白兔（500 μg/只）進(jìn)行首免。隨后，每2周利用弗氏不完全佐劑和偶聯(lián)的抗原肽（250 μg/只），進(jìn)行加強(qiáng)免疫。第7次免疫1周后采血，制備多抗血清。利用間接ELISA對抗體的滴度進(jìn)行測定，結(jié)果顯示該多抗血清ELISA效價超過105，具體的結(jié)果詳見表1。最后，利用IgG親和層析的方法獲得純化的抗體（1.0 mg/mL）。

1.4 蛋白樣品制備

1.4.1 真核表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 待293T細(xì)胞在細(xì)胞板長到70%～80%滿時，將空載體p3XFLAG-CMV-14以及實驗室保存的構(gòu)建好的Flag14-GP7質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染5 h后換液，換成2%含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基，24 h后收取目的蛋白。

1.4.2 不同時間點感染PRRSV的蛋白樣品 使用0.1 MOI劑量的HP-PRRSV（SY0608毒株）感染Marc-145細(xì)胞，感染2 h后換成2%含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基，待換液12、24、36、48 h后，分別收取目的蛋白，同時設(shè)空白對照組。

1.4.3 感染PRRSV不同毒株的蛋白樣品 將3種不同毒株HP-PRRSV (SY0608)、CH1R、JX1R分別感染Marc-145細(xì)胞，感染量均為0.1 MOI，感染24 h后收取蛋白樣品。

1.5 多克隆抗體特異性檢測

1.5.1 Western blot 用15%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDSPAGE，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印至PVDF膜。轉(zhuǎn)印2 h后，用5%脫脂乳常溫?fù)u床封閉PVDF膜3 h；棄掉封閉液后用TBST漂洗，隨后加入制備好的N蛋白抗體（1∶2000），4℃搖床孵育過夜；再用TBST洗3次，每次搖動漂洗10 min，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（1:5000），室溫?fù)u床孵育1.5 h；用TBST洗3次，每次搖動漂洗10 min，暗室中進(jìn)行顯影，使用ECL顯色發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色。

1.5.2 間接免疫熒光分析（IFA） 將Marc-145細(xì)胞均勻鋪至24孔板中，待長到80%時接入0.1 MOI HP-PRRSV（SY0608毒株），感染24 h后用多聚甲醛固定0.5 h。PBS漂洗3遍后，1% NP40進(jìn)行作用15 min。再用PBS漂洗3次，每次1 min，用含2%羊血清的封閉液室溫封閉30 min，室溫孵育一抗1 h：自制的N蛋白抗體按1∶100稀釋，商業(yè)化的抗PRRSV N蛋白抗體（SDOW17A）按1∶400稀釋。PBS洗3次，每次5 min，室溫避光孵育二抗1 h：自制的 N蛋白二抗使用羊抗兔 594 IgG (1:400稀釋)，其中 PRRSV感染的Marc-145細(xì)胞顯示為紅色；商業(yè)化的抗PRRSV N抗體（SDOW17A）的二抗使用羊抗鼠488 IgG（1∶400稀釋），PRRSV感染的Marc-145細(xì)胞顯示為綠色。隨后用PBS搖床上洗3次，每次5 min。然后DAPI染色10 min，PBS洗3次，每次5 min，最后用封片劑進(jìn)行粘片。

2 結(jié)果

2.1 針對抗原肽的多克隆抗體滴度檢測 采用間接ELISA 測定抗體效價。當(dāng)制備的N 蛋白抗體稀釋比例為1∶3125時，Rabbit1的OD450值為2.292，Rabbit2的OD450值為2.335，均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于標(biāo)準(zhǔn)值0.3；當(dāng)稀釋比例不斷增加，達(dá)到1∶100 000時，Rabbit1、Rabbit2 OD450分別為0.311、0.472，依舊大于0.3。同時對照組兔陰性血清稀釋比例為1∶1000時，OD450為0.054，小于標(biāo)準(zhǔn)值0.2，說明制備的兔抗N蛋白多克隆抗體ELISA效價可達(dá)到105（表1）。

2.2 多克隆抗體特異性分析 為了驗證該多克隆抗體的特異性，利用Western blot 方法對分別轉(zhuǎn)染Flag14-GP7及空載體的293T細(xì)胞樣品進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，利用該抗原肽的抗體，僅在Flag14-GP7的細(xì)胞樣品中，檢測到約16 kDa大小的條帶，結(jié)果見圖1A。同時，利用抗Flag的抗體對上述樣品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)也僅在Flag14-GP7的細(xì)胞樣品中，檢測到約16 kDa大小條帶，結(jié)果見圖1B。因此，我們的結(jié)果顯示該多克隆抗體可以特異地識別PRRSV N蛋白。

表1 ELISA 效價檢測結(jié)果Table 1 ELISA titer of N protein antibody

圖1 N蛋白Western blot 分析Fig. 1 Western blot analysis of protein N

2.3 多克隆抗體的應(yīng)用

2.3.1 HP-PRRSV感染的細(xì)胞中N蛋白檢測 為了驗證該多克隆抗體可以應(yīng)用于檢測PRRSV感染樣品中N蛋白，利用Western blot分析感染HP-PRRSV 后不同時間點的Marc-145細(xì)胞樣品。結(jié)果顯示，該多克隆抗體可有效地識別HP-PRRSV感染樣品中的N蛋白，并且隨著時間的推移，N蛋白的表達(dá)量也逐漸增加（圖2）。

圖2 PRRSV感染不同時間點N蛋白表達(dá)情況Fig. 2 The expression of N protein at different time poin after PRRSV infection

2.3.2 PRRSV不同毒株感染的細(xì)胞中N蛋白檢測 為了驗證該多克隆抗體可以識別PRRSV不同毒株中的N蛋白，我們利用Western blot對SY0608、CH1R、JX1R毒株感染的細(xì)胞樣品進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，該多克隆抗體可以特異地識別上述毒株感染細(xì)胞中的N蛋白（圖3）。

圖3 不同PRRSV毒株感染Marc-145細(xì)胞后的N 蛋白表達(dá)情況Fig. 3 The expression of N protein in Marc-145 cells infected with different PRRSV strains

2.3.3 間接免疫熒光分析（IFA） 為了驗證該多克隆抗體也可以應(yīng)用于IFA，利用該多克隆抗體與商業(yè)化的抗體對PRRSV感染的細(xì)胞樣品進(jìn)行IFA。結(jié)果顯示，在熒光顯微鏡下兩種抗體都可以檢測到PRRSV感染的細(xì)胞，并且陽性細(xì)胞完全吻合，結(jié)果見圖4。

圖4 N蛋白抗體間接免疫熒光效價檢測結(jié)果Fig. 4 Indirect immuno fl uorescence assay of Flag14-GP7 PcAb

3 討論

本研究成功篩選獲得用于PRRSV N蛋白抗體制備的抗原肽。針對該抗原肽的多克隆抗體，不僅可以識別過表達(dá)的PRRSV N蛋白，而且可以有效地識別病毒感染的PRRSV N蛋白，還可以與不同毒株的N蛋白反應(yīng)。因此，通過生物學(xué)預(yù)測獲得的PRRSV N蛋白多肽可以應(yīng)用于針對PRRSV N蛋白多克隆抗體的制備，為將來研制有效的抗PRRSV N蛋白商業(yè)化的抗體奠定了基礎(chǔ)。

N蛋白作為PRRSV感染過程中含量最豐富的病毒蛋白，已成為病毒感染檢測的指示蛋白。例如用于病毒感染的診斷[14]以及病毒與宿主相互作用過程中的病毒檢測[15]。在這些研究中，針對PRRSV N蛋白抗體的制備，主要依賴于原核表達(dá)獲得重組抗原。為了避免原核表達(dá)純化的繁瑣程序，本研究聚焦于HP-PRRSV N蛋白，利用生物信息學(xué)和蛋白合成技術(shù)，獲得PRRSV N蛋白的抗原多肽。根據(jù)Blast軟件比對的結(jié)果，該抗原多肽在“北美型”PRRSV毒株中高度保守，與“歐洲型”毒株的N蛋白同源比較低（約為60%，結(jié)果未顯示）。研究顯示針對該抗原肽的多克隆抗體可以用于不同毒株中N蛋白的檢測，這一結(jié)果與我們Blast的結(jié)果吻合。盡管目前該多克隆抗體是否可應(yīng)用于不同型PRRSV的檢測還沒有得到驗證，但是本研究結(jié)果顯示，至少該多克隆抗體可以用于“北美型”PRRSV N蛋白的檢測。

PRRSV在世界范圍內(nèi)廣泛存在，已成為危害我國養(yǎng)豬業(yè)的“頭號元兇”。深入開展PRRSV與宿主相互作用的研究對揭示PRRSV的免疫致病機(jī)制具有重要的基礎(chǔ)意義。然而目前開展這些研究往往受制于特異性的抗體。針對PRRSV N蛋白的商業(yè)化的抗體還非常有限，其中SDOW17A是其中比較成功的抗體，但是該抗體不能夠應(yīng)用于Western blot（至少不能夠與“北美型” PRRSV N蛋白反應(yīng)）。本研究利用該抗原肽獲得的抗體不僅可以應(yīng)用于IFA，同時還可以應(yīng)用于Western blot，并且具有非常好的反應(yīng)性。因此，本研究結(jié)果不僅為檢測 PRRSV N蛋白提供了選擇，而且彌補(bǔ)了SDOW17A抗體的不足，進(jìn)而為制備新的用于PRRSV N蛋白檢測的商業(yè)化抗體奠定了基礎(chǔ)。

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PREDICTION AND SYNTHESIS OF ANTIGEN PEPTIDE OF PRRSV N PROTEIN AND ITS APPLICATION FOR GENERATION OF ANTIBODY

XIANG Xiao, ZHANG Yan-bing, SHI Yuan-yuan, LI Yu-ming, LIU Ke, WEI Jian-chao, SHAO Dong-hua,LI Bei-bei, TONG Guang-zhi, MA Zhi-yong, QIU Ya-feng

(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

To date, prediction of antigen peptides based on bioinformatics, chemical synthetic and immunological techniques has been commonly used for generation of antibodies. Here, we determined the possibility of generation of speci fi c antibody against PRRSV N protein by using predicted antigen peptide. First, one antigen peptide (16 amino acids) close to N terminal of was predicted from N protein of a highly pathogenic PRRSV strain. Then, the BLAST analysis showed that this peptide was conserved in different North American PRRSV strains. Secondly, this antigenic peptide was synthesized by using Fmoc solid phase method and coupled to the KLH vector protein by MBS method. Subsequently, New Zealand white rabbits were immunized with the conjugated antigenic peptide emulsi fi ed with Freund's complete or incomplete adjuvant. The antiserum was collected from the immunized rabbit and antibodies were puri fi ed using IgG af fi nity chromatography. The puri fi ed antibodies showed good signals at dilution of over 105 in ELISA. When used at dilution of 1：2000 in Western blotting, the antibodies reacted with N protein from Marc-145 cells infected with different PRRSV strains. The dilution of 1：200 of this antibody preparation was used in IFA for detection of PRRSV in infected cells. Collectively, the antigen peptide of the PRRSV N protein was predicted using bioinformatics software and used for generation of antibodies, which showed good reactivity in ELISA, Western blot and IFA.

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus; nucleocapsid protein; antigen peptide; antibody

S852.43

A

1674-6422（2017）06-0019-06

2017-08-29

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（2014JB15、2015ZL065）；國家自然基金（31502046）；973計劃項目（2014CB542702）

相笑，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

邱亞峰，E-mail：yafengq@shavri.ac.cn; 馬志永，E-mail：zhiyongma@shvri.ac.cn