錢 琨，孔正茹，張 杰，秦愛建

（1.揚州大學 教育部禽類預防醫(yī)學重點實驗室，揚州 225009；2.揚州大學 江蘇省動物預防醫(yī)學重點實驗室，揚州 225009；3.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州225009）

銀杏外種皮多糖抑制J亞群禽白血病病毒在DF-1細胞中的復制

錢 琨1,2,3，孔正茹1,2，張 杰1,2，秦愛建1,2,3

（1.揚州大學 教育部禽類預防醫(yī)學重點實驗室，揚州 225009；2.揚州大學 江蘇省動物預防醫(yī)學重點實驗室，揚州 225009；3.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州225009）

為研究銀杏外種皮多糖抑制J亞群禽白血病病毒（Avian leukosis virus subgroup J，ALV-J）復制的能力，在不同時間點加入銀杏外種皮多糖處理DF-1細胞，利用qRT-PCR、免疫蛋白印跡以及病毒滴度檢測等方法，觀察銀杏外種皮多糖對ALV-J復制的影響，結(jié)果表明銀杏外種皮多糖就能夠顯著地抑制病毒基因表達、蛋白合成以及病毒在細胞內(nèi)的增殖，并且這種抑制作用具有時間和劑量依賴性。同時銀杏外種皮多糖處理還明顯抑制病毒感染細胞中的IL-1β、TNFα等細胞因子的表達。銀杏外種皮多糖在DF-1細胞中具有抑制ALV-J復制的能力，具有作為抗ALV-J藥物的潛力。

J亞群禽白血病病毒；銀杏外種皮多糖；病毒復制；抑制

禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）是逆轉(zhuǎn)錄病毒科、α-逆轉(zhuǎn)錄病毒屬的成員。ALV在全世界范圍內(nèi)引起雞群的免疫抑制，臨床腫瘤和生產(chǎn)性能下降。根據(jù)病毒的宿主范圍，囊膜蛋白的序列以及中和抗體的反應，將感染雞的外源性ALV分為不同的亞群（A、B、C、D和J）[1]。流行病學調(diào)查數(shù)據(jù)表明，J亞群禽白血病病毒（ALV-J）是我國雞群中的優(yōu)勢亞群。由于我國家禽飼養(yǎng)管理環(huán)境的復雜，ALV-J曾經(jīng)在我國四處肆虐，不僅感染肉雞，還大范圍感染蛋雞和地方品種雞群，嚴重影響我國養(yǎng)禽業(yè)健康、快速的可持續(xù)發(fā)展[2]。由于病毒囊膜基因具有高突變率，病毒-宿主相互作用也不甚清楚，目前還沒有特別有效的疫苗和治療手段，主要采取核心種雞群的檢測與凈化，從而控制禽白血病在雞群中的流行。

研究表明，一些天然產(chǎn)物例如中藥、植物衍生化合物等在體內(nèi)外具有抑制病毒的潛力，可以作為抗病毒藥物使用[3-5]。王英燕等[5]指出檳榔、常山浸出液與流感病毒混合可明顯抑制流感病毒的感染；黃柏、虎杖、蠶砂、貫眾、魚腥草等對雛鴨病毒性肝炎病毒有抑制作用；此外，大青葉、黃答、金銀花、板藍根等對呼吸道病毒也具有抑制作用。銀杏外種皮是銀杏果仁的皮層，其化學成分與銀杏葉相似，含有較多的黃酮類化合物、銀杏內(nèi)酯類化合物、銀杏酚類化合物和類胡蘿卜素等有效成分[6]。銀杏外種皮多糖（ginkgo biloba exocarp polysaccharide，GBEP）是從銀杏外種皮中提取出來的一種活性成分，毒副作用極低。研究報道銀杏外種皮多糖具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和抗衰老等多種活性[7-9]，但對其抗病毒活性的研究鮮有報道。

本研究旨在探究銀杏外種皮多糖在DF-1細胞中抑制ALV-J病毒復制的能力，為其作為藥物在防控禽白血病凈化工作中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 生物材料和試劑 禽源DF-1細胞為本實驗室保存；J亞群禽白血病病毒JS09-GY3毒株為本實驗室分離并鑒定；針對J亞群禽白血病病毒囊膜蛋白env特異性單克隆抗體JE9由本實驗室前期研制并保存；內(nèi)參抗體α-Tubulin購自Sigma公司；銀杏外種皮多糖（GBEP）由揚州大學李金貴教授饋贈，其純度為71%，滅菌ddw溶解；總RNA提取試劑盒購自Axygen公司；BCA試劑盒購自碧云天公司；HRP標記的羊抗鼠IgG購自Sigma公司；RIPA細胞裂解液購自Cell Signaling公司；蛋白酶抑制劑購自Roche公司；HRP的增強型化學發(fā)光底物液購自Themer公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 銀杏外種皮多糖對細胞毒性的測定 將不同濃度的銀杏外種皮多糖 (0、20、50、100、200 μg/mL)加入DF-1細胞培養(yǎng)72 h后，每孔加入20 μL CCK-8溶液，按照CCK-8細胞活力檢測試劑盒（碧云天公司）說明書操作。

1.3 銀杏外種皮多糖處理細胞 使用不同濃度銀杏外種皮多糖（0、1、20 μg/mL）預處理DF-1細胞5 h后，加入銀杏外種皮多糖與病毒的混合液進行病毒吸附3 h，換液后加入含有銀杏外種皮多糖的維持液繼續(xù)維持到病毒感染72 h，收集細胞裂解提取RNA，進行real-time PCR檢測基因表達情況。部分細胞利用RIPA裂解進行Western blot檢測病毒蛋白表達情況；同時細胞上清進行TICD50檢測病毒增殖情況。此外，在時間依賴性實驗中，使用固定銀杏外種皮多糖溶度(20 μg/mL)，在加入病毒感染后24、48、72 h分別收集細胞裂解提取RNA，進行real-time PCR檢測病毒基因表達情況。

1.4 Western blot鑒定 細胞裂解液利用BCA蛋白定量試劑盒定量后，進行SDS-PAGE電泳；將蛋白轉(zhuǎn)印到NC膜上后放入TBST稀釋的5%脫脂乳中37℃搖床封閉1.5 h；針對J亞群禽白血病病毒囊膜蛋白env特異性單克隆抗體JE9和內(nèi)參抗體α-Tubulin作為一抗4℃孵育過夜；TBST洗滌3次，5 min/次；二抗為1:10 000標記的山羊抗鼠IgG，37℃搖床孵育1 h；TBST洗滌5次，5 min/次；最后HRP增強型化學發(fā)光底物避光顯色5 min，于超靈敏化學發(fā)光成像系統(tǒng)拍照并記錄結(jié)果。

1.5 銀杏外種皮多糖不同加入時間對ALV-J復制的影響 根據(jù)參考文獻[10]，銀杏外種皮多糖（20 μg/mL）分別于預處理細胞5 h，藥物與病毒共同吸附細胞3 h，病毒吸附后加入藥物繼續(xù)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h三個時間點單獨加入DF-1細胞；另設(shè)置不加藥物病毒感染作為對照，采用TCID50檢測銀杏外種皮多糖對病毒增殖的影響。實驗設(shè)計如圖1所示。

圖1 銀杏外種皮多糖不同加入時間對ALV-J感染復制的影響實驗設(shè)計圖Fig.1 Experiment design of antiviral effects of different treatment times of GBEP on ALV-J infection replication

1.6 real-time PCR檢測 按照Axygen公司的總RNA小量制備試劑盒說明書提取組織總RNA，紫外分光光度計檢測RNA的純度和濃度。取1 μg總RNA作為模板，用TaKaRa公司的PrimerScriptTM RT reagent kit with gDNA Eraser（Perfect for Real Time）試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為檢測模板。反轉(zhuǎn)錄好的cDNA作為模板用ddw對其進行1:10稀釋。按照說明書配制反應液：SYBR Premix ExTaqTMⅡ 10 μL、ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL、上下游引物各0.8 μL、ddw 6 μL、模板2 μL，共20 μL。PCR反應程序為：95℃預變性30s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40個循環(huán)。real-time PCR數(shù)據(jù)采集在ABI 7500系統(tǒng)上進行，以GAPDH為內(nèi)參基因?qū)毎麡颖具M行歸一化處理，每份樣品設(shè)置3個重復。

為進一步研究銀杏外種皮多糖抑制病毒復制的機制，將銀杏外種皮多糖處理組與對照組細胞裂解提取RNA后，進行real-time PCR檢測細胞因子IL-1β、IFNβ、TNF-α，從而反應銀杏外種皮多糖對病毒感染細胞的作用。real-time PCR引物見表1。

2 結(jié)果

2.1 銀杏外種皮多糖細胞毒性檢測 不同濃度的銀杏外種皮多糖（0、20、50、100、200 μg/mL）與 DF-1細胞孵育72 h后，加入CCK-8檢測細胞毒性。結(jié)果顯示銀杏外種皮多糖在濃度達到200 μg/mL處理細胞時，仍然對DF-1細胞沒有毒性，并且5～200 μg/mL對細胞作用沒有差異，如圖2所示。根據(jù)已發(fā)表的文獻結(jié)合后期的抗病毒效果并考慮到實驗用量以及以后的臨床推廣，選擇20 μg/mL的銀杏外種皮多糖劑量繼續(xù)進行后續(xù)的實驗。

表1 Real-time PCR引物序列Table1 Primer sequences of real-time PCR

圖2 不同濃度GBEP的細胞安全性檢測Fig.2 Cell viability of DF-1 cells treated by GBEP with various concentrations

2.2 銀杏外種皮多糖抑制病毒基因表達 在ALV-J復制過程中加入銀杏外種皮多糖，可以明顯觀察到在20 μg/mL濃度下，GBEP極顯著地抑制病毒gp37基因的表達，并且這種抑制效果呈現(xiàn)劑量和時間依賴性，結(jié)果見圖3。

圖3 GBEP抑制病毒基因表達呈劑量與時間依賴性Fig.3 Inhibition of virus replication by GBEP in a dose and time dependent manner

2.3 銀杏外種皮多糖抑制病毒蛋白合成與病毒增殖為了檢測GBEP對病毒蛋白合成和增殖的影響，收集病毒復制72 h的上清進行TCID50檢測，裂解細胞液進行Western blot檢測病毒蛋白合成。圖4結(jié)果清晰的顯示，GBEP明顯抑制病毒蛋白的合成以及病毒的增殖，進一步驗證了GBEP在DF-1細胞中具有抑制ALV-J復制的能力。

圖4 GBEP抑制病毒蛋白合成和病毒增殖Fig.4 Inhibition of viral protein expression and viral proliferation by GBEP

2.4 銀杏外種皮多糖不同加入時間對ALV-J復制的影響 為了進一步探究銀杏外種皮多糖抑制病毒復制的作用環(huán)節(jié)，按照圖1的實驗設(shè)計，不同時間點加入GBEP處理細胞，待病毒感染72 h后收取細胞懸液，檢測病毒的增殖情況。結(jié)果表明GBEP在細胞前處理、病毒吸附和病毒感染后3個階段都發(fā)揮明顯的抗病毒作用，呈現(xiàn)出多位點、多環(huán)節(jié)的作用，但具體的機制還有待日后實驗來闡明（圖5）。

圖5 銀杏外種皮多糖在不同加入時間抑制ALV-J增殖的作用Fig. 5 Antiviral effects of GBEP on ALV-J proliferation at different time points

2.5 銀杏外種皮多糖對病毒感染細胞中細胞因子表達的影響 根據(jù)以往的報道，銀杏外種皮多糖具有調(diào)節(jié)淋巴細胞免疫活性的作用[7,9]。因此，本研究檢測了GBEP處理后病毒感染細胞中IL-1β、IFNβ和TNF-α的表達水平。結(jié)果顯示，GBEP極其顯著地抑制病毒感染細胞中IL-1β和TNF-α的表達，而對抗病毒細胞因子IFNβ的表達沒有任何影響（圖6）。GBEP抑制細胞因子表達與抑制病毒復制存在怎樣的關(guān)聯(lián)，還需進一步的深入研究。

圖6 銀杏外種皮多糖對ALV-J感染DF-1細胞因子表達影響Fig.6 Effects of GBEP on cytokines expression in ALV-J infected cells

3 討論

近年來，由于國家相關(guān)機構(gòu)和國內(nèi)大型育種公司的重視，禽白血病在局部地區(qū)得到有效控制和凈化，發(fā)病率和死亡率正在下降。在禽白血病凈化工作中，除了嚴格的淘汰病毒感染陽性個體外，還需要有效的抗病毒化合物以防止雞群再次感染和水平傳播。隨著國家對食品安全高度重視，抗生素和其他抗病毒藥物的使用越來越標準化和規(guī)范化，許多藥物由于其毒副作用高，對機體器官損傷大，已經(jīng)成為禁用藥。而傳統(tǒng)中藥有廣泛的來源，具有副作用低、無殘留的特點。此外，它還具有改善免疫系統(tǒng)，抗病毒和抗腫瘤的生物學特性，因此中藥已經(jīng)逐漸成為一個令人關(guān)注的熱門話題，特別是在東亞、遠東和非洲國家及地區(qū)[3,4]?？共《局兴幍难邪l(fā)為病毒的預防和治療提供新型安全手段。

銀杏是世界上珍貴的藥用植物資源，它的葉、果和外種皮等都有藥用開發(fā)價值。利用銀杏葉生產(chǎn)的銀杏提取物制劑是暢銷國內(nèi)外的天然藥物之一，同時銀杏果開發(fā)的各種營養(yǎng)食品在國內(nèi)外市場中都有銷售[11]。銀杏外種皮多糖是從銀杏外種皮中提取出來的一種活性多糖，毒副作用低。研究表明，銀杏外種皮中GBEP含量較高，并具有提高機體免疫、延緩衰老、促進超氧化物歧化酶形成、殺滅腫瘤細胞等作用[12-14]。但是國內(nèi)外利用銀杏外種皮多糖進行抗病毒的研究非常少，僅夏前賢等[15]發(fā)現(xiàn)銀杏外種皮多糖具有抵抗NDV在雞胚內(nèi)復制的能力。

本研究較為詳細的研究了GBEP對ALV-J復制的抑制作用。首次發(fā)現(xiàn)，GBEP在DF-1細胞中顯著地抑制病毒基因表達、蛋白合成以及病毒的增殖，而且這種抗病毒作用呈現(xiàn)劑量和時間依賴性。以往中藥抗病毒作用主要集中于黃酮類化合物的抗病毒效果[3]，而本研究發(fā)現(xiàn)GBEP具有抑制家禽白血病病毒的能力，而且這種抗病毒作用在病毒復制的多個環(huán)節(jié)都有效，說明GBEP抗病毒的活性值得關(guān)注。本研究還檢測了GBEP對病毒感染細胞中免疫相關(guān)細胞因子的檢測，發(fā)現(xiàn)GBEP強力抑制IL-1β和TNF-α的表達，而對常規(guī)抗病毒干擾素IFNβ的表達沒有任何影響。臨床中ALV-J病毒感染易感宿主最終引起多器官的腫瘤。腫瘤在形成過程中伴隨著大量炎癥因子的表達，過度的炎癥因子表達對正常器官是一種損傷。雖然炎癥因子表達高低與ALV-J復制的關(guān)系還不清楚，但是從臨床腫瘤形成可以推斷，炎癥因子可能有助于病毒的復制。本研究結(jié)果顯示，GBEP在抑制ALV-J復制過程中，明顯抑制病毒感染細胞中IL-1β和TNF-α兩種炎癥因子的表達，是否是GBEP抗病毒的關(guān)鍵還需要更多的實驗來證明。此外，ALV-J是一種免疫抑制性病毒，病毒感染后并不引起細胞或者宿主干擾素表達的增加[16]。GBEP的處理也未顯著提高IFNβ的表達。這一結(jié)果提示我們，作為天然免疫抗病毒的主要干擾素家族在GBEP抑制ALV-J復制過程中并未發(fā)揮作用，其中具體的機理有待日后深入研究來闡明。

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ANTIVIRAL ACTIVITY OF GINKGO BILOBA EXOCARP POLYSACCHARIDE AGAINST SUBGROUP J AVIAN LEUKOSIS VIRUS IN DF-1 CELL

QIAN Kun1,2,3, KONG Zheng-ru1,2, ZHANG Jie1,2, QIN Ai-jian1,2,3

(1. Ministry of Education Key Lab for Avian Preventive Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China; 2. Key Laboratory of Jiangsu Preventive Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China;; 3. Jiangsu Co-innovation Centre for the Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

To investigate the antiviral effects of ginkgo biloba exocarp polysaccharide (GBEP) on the replication of Avian leukosis virus subgroup J (ALV-J), DF-1 cells were treated with GBEP at different time points. The results indicated that GBEP strongly inhibited viral gene transcription, protein expression and virus titers through dose and time dependent manners as detected using qRT-PCR, Western blot and TCID50assays. We also noted that GBEP greatly down-regulated the expression of IL-1β, TNFα and other immune related cytokines.Overall, this study highlighted that GBEP exerted its anti-avian leukosis virus activity and might be developed as a preventive drug for ALV-J infection in the future.

Avian leukosis virus subgroup J; ginkgo biloba exocarp polysaccharide; virus replication; inhibition

S852.659.3

A

1674-6422（2018）01-0013-06

2017-08-30

國家重點研發(fā)計劃(2017YFD0500700、2016YFD0500800)；國家自然科學基金(31772734)；江蘇省優(yōu)勢學科項目；揚州大學新世紀人才項目

錢琨,男,博士,副教授,主要從事動物微生物及免疫學研究；孔正茹，女，碩士研究生，預防獸醫(yī)學專業(yè)

錢琨，E-mail: qiankun@yzu.edu.cn