段燕喻，陳 茹，吳曉薇，朱道中，林志雄，田純見，劉志玲

（廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東省動植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510623）

病毒性神經(jīng)壞死?。╒iral nervous necrosis，VNN）又稱病毒性腦病和視網(wǎng)膜?。╒iral encephalopathy and retinopathy，VER）[1]。 其 病原為神經(jīng)壞死病病毒（Nervous necrosis virus，NNV），可感染多種石斑魚（Epinephelus akaara、Epinephelus septemfasciatus、Epinephelus fuscogutatus）[2-4]、尖 吻 鱸魚（Latescalcarife）[5]、大菱鲆[6]等40多種海水魚類。該病在世界范圍內(nèi)廣泛暴發(fā)，對仔魚和幼魚危害很大，感染后死亡率極高，嚴(yán)重的1周內(nèi)死亡率可達(dá)100%[7-8]。病魚主要表現(xiàn)為不同程度的神經(jīng)異常和厭食，浮于水面旋轉(zhuǎn)游動。組織學(xué)觀察可見視網(wǎng)膜、腦中樞神經(jīng)組織出現(xiàn)空泡。已有研究表明[3，9]，該病已從海水魚傳播到淡水魚，從幼魚傳播到成魚，給各國海水養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失。VNN被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）、亞太水產(chǎn)養(yǎng)殖中心協(xié)作網(wǎng)（NACA）列入水生動物病害名錄，被我國列為二類動物疫病。各國在進(jìn)出境水生動物檢疫中，將其作為重要的檢疫項(xiàng)目。

目前國內(nèi)外已報道的VNN檢測方法大致可分為免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法和細(xì)胞培養(yǎng)法3大類。其中：免疫學(xué)方法包括ELISA[10]、免疫熒光技術(shù)[11]、免疫組織化學(xué)方法等；分子生物學(xué)方法主要包括RT-PCR[12]、巢式RT-PCR[13]、實(shí)時熒光定量PCR[14]等。但由于細(xì)胞培養(yǎng)法耗時長，免疫學(xué)方法制備單克隆抗體難，因此這些方法在VNN臨床檢測中推廣難度較大。分子生物學(xué)檢測方法以檢測快速、特異好和敏感性高等優(yōu)點(diǎn)，在VNN檢測中得到廣泛應(yīng)用。

國內(nèi)外學(xué)者對VNN的RT-PCR檢測，較多選取RNA2基因設(shè)計引物及探針[15-17]。OIE《水生動物疾病診斷手冊》中推薦的VNN分子生物學(xué)方法也將RNA2基因作為目標(biāo)基因。但由于缺少檢驗(yàn)用的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，影響了實(shí)驗(yàn)室間檢測結(jié)果的比對和互認(rèn)，且活病毒的流通存在生物安全風(fēng)險，不利于質(zhì)控樣品的傳遞，因此開展VNN標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究，對確保核酸檢測陽性質(zhì)控均一、安全有效具有重要意義。

本研究根據(jù)OIE《水生動物疾病診斷手冊》推薦的VNN熒光RT-PCR檢測方法，設(shè)計特異性引物，擴(kuò)增NNV的RNA2基因片段，經(jīng)克隆轉(zhuǎn)錄獲取大量的cRNA，將其作為NNV陽性核酸物質(zhì)，并從均一性、穩(wěn)定性、定值和不確定度等幾個方面進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 菌毒株及載體

NNV毒 株（Red-spotted grouper nervous necrosis virus，RGNNV）為深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動植食檢測中心水生實(shí)驗(yàn)室贈送；pGEM-T Easy Vertor System II 載體為Promega公司產(chǎn)品；JM109大腸桿菌化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞為北京天根生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要儀器與試劑

7500FAST熒光PCR儀：ABI公司產(chǎn)品；NanoDrop1000紫外分光儀：ThermoFisher公司產(chǎn)品；冷凍干燥儀器：Christ公司產(chǎn)品；RNA 提取試劑盒、體外轉(zhuǎn)錄試劑盒：Promega公司產(chǎn)品；一步法RTPCR試劑盒、限制性內(nèi)切酶Nde I：TAKARA公司產(chǎn)品；DNA膠回收試劑盒：Axygen 公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒、RNA純化試劑盒：北京天根生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備用毒株鑒定

RGNNV滅活病毒懸液由深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局國家水生動物疫病檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室贈送。采用OIE《水生動物疫病診斷手冊》（第2.3.11章）推薦的常規(guī)RT-PCR方法鑒定，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測定后，與GenBank登錄的NNV序列進(jìn)行同源性比對，確認(rèn)該毒株為NNV，可將其用于NNV核酸檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備

1.4.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)GenBank登錄的NNV毒株序列，以及OIE《水生動物疫病診斷手冊》中NNV檢測方法推薦的引物，選擇RNA2基因中相對保守區(qū)域，設(shè)計用于克隆NNV RNA2基因的特異性擴(kuò)增引物（表1），并由Thermo Fisher公司合成。以病毒核酸為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增后，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測定。將序列正確的特異性基因片段連接于pGEM-Teasy載體，轉(zhuǎn)化至JM109大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞；挑取白色菌落，經(jīng)RT-PCR鑒定及序列測定鑒定為陽性后，用天根公司的高濃度質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提??；將該重組質(zhì)粒命名為pGEM-RNA2。

表1 NNV RNA2基因的擴(kuò)增引物

1.4.2 NNV RNA2基因體外轉(zhuǎn)錄 選擇重組質(zhì)粒中位于NNV RNA2基因下游的Nde I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，對pGEM-RNA2進(jìn)行單酶切，使其線性化后采用DNA 膠回收試劑盒純化，用T7 RiboMAXTMLarge scale RNA production system進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄序列從pGEM-RNA2載體的啟動子開始至Nde I酶切位點(diǎn)止。轉(zhuǎn)錄體系總體積為100 μL，包含以下組分：T7 Transcription 5×Buffer 20 μL、dNTPs（25 mmol/L）30 μL、線性化質(zhì)粒5～10 μg、Enzyme Mix（T7）10 μL、ddH2O 40 μL?；靹蚝笾?7 ℃反應(yīng)5 h，接著向體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中加入10 μL DNA酶，37 ℃反應(yīng)15 min以去除DNA模板，最后用天根RNA純化試劑盒提取純化，去除體系中的雜質(zhì)。將RNA沉淀溶于RNase-Free H2O中，即得到純的RNA2-cRNA片段。

1.4.3 RNA2-cRNA純度及初步定量 取制備的RNA2-cRNA做100倍稀釋；用Nano Drop 1000紫外分光儀測定其在260 nm與280 nm處的OD值；根據(jù)OD260/OD280值分析溶液中的RNA純度。OD260/OD280在1.8～2.0，說明 RNA的純度較高；比值低于1.8，說明RNA樣品有殘余蛋白質(zhì)存在；比值高于2.0，則表明RNA可能降解。同時根據(jù)單鏈RNA的相對分子質(zhì)量（MW），按下式計算出RNA2-cRNA的拷貝數(shù)濃度。拷貝數(shù)（copies/μL）=（6.02×1023拷貝數(shù) /mol）× 濃度（g/μL）/分子量（g/mol）。

1.4.4 RNA2-cRNA稀釋與分裝保存 將制備的RNA2-cRNA，用RNase-Free H2O系列稀釋成108～104copies/μL；采用熒光 RT-PCR 方法測定各濃度Ct值，從而獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程。將108copies/μL的樣品混勻后分裝入凍存管，每管1.0 mL，分裝300管，分別保存于室溫（20～25 ℃）、冷藏（2～8 ℃）和冷凍（-20 ℃）。每個溫度下保存20支，剩余的保存于-80 ℃。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)樣品檢測分析

1.5.1 均勻性檢驗(yàn) 從-80 ℃保存的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品中，隨機(jī)抽取10支，編號后用OIE《水生動物疫病診斷手冊》第2.3.11章中的病毒性神經(jīng)壞死病熒光RT-PCR方法檢測Ct值，以此檢驗(yàn)批間均勻性。從每管樣品分別抽取10 μL混合，用熒光RT-PCR方法測定10次，用于檢驗(yàn)批內(nèi)均勻性。

1.5.2 穩(wěn)定性檢驗(yàn) 不同溫度條件保存樣品時間如下：室溫（20～25 ℃）7 d；冷藏（2～8 ℃）1個月；冷凍（-20 ℃）6個月；冷凍（-80 ℃）長期保存。依次作為不同條件下的穩(wěn)定性對照組。各溫度條件保存期結(jié)束后，分別隨機(jī)抽取4支，應(yīng)用OIE推薦的熒光RT-PCR方法檢測Ct值；采用雙樣本等方差假設(shè)的t檢驗(yàn)，對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，評價標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性。

1.5.3 定值檢測與協(xié)作標(biāo)定 本次定值采用測定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度，根據(jù)片段長度換算拷貝數(shù)和協(xié)作標(biāo)定的方式，聯(lián)合7家權(quán)威實(shí)驗(yàn)室，對制備好的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定值。

1.5.4 不確定度分析 本研究定值結(jié)果的不確定度主要包括設(shè)備、試劑和人員操作誤差。應(yīng)用A類評定方法進(jìn)行不確定度評定。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備用毒株鑒定和篩選

備用毒株經(jīng)OIE推薦的常規(guī)RT-PCR檢測方法鑒定為陽性；測序所得序列經(jīng)NCBI BLAST與GenBank登錄的其他NNV毒株序列比，發(fā)現(xiàn)同源性達(dá)95%以上。結(jié)果表明，所選取的RNA2基因可以有效代表NNV的核苷酸序列，可用于核酸檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制。

2.2 RNA2基因片段擴(kuò)增

提取NNV病毒RNA，采用表1中的引物，成功擴(kuò)增RNA2基因序列；擴(kuò)增產(chǎn)物長度為677 bp，片段大小符合預(yù)期（圖1）。

圖1 NNV RNA2基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 RNA2-cRNA純度及含量

測定RNA2-cRNA 260 nm與280 nm的吸光度值（OD）。OD260/OD280=1.92，表明所獲得的cRNA純度較高。pGEM-RNA2的摩爾質(zhì)量為2.64×105g/mol；根據(jù)公式計算樣品的拷貝濃度為8.41×1012copies/μL（表 2）。

表2 RNA2-cRNA純度及含量

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取稀釋成8.41×108～8.41×104copies/μL各濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，每個濃度設(shè)2個重復(fù)，進(jìn)行實(shí)時熒光定量RT-PCR，測定Ct值。以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由儀器自帶軟件得出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y= -4.327X+52.125，R2=0.958（圖2、圖3）。

圖2 不同稀釋度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的擴(kuò)增曲線

2.5 均勻性檢驗(yàn)

采用熒光定量RT-PCR方法，對隨機(jī)抽取的10支標(biāo)準(zhǔn)樣品與混合后的標(biāo)準(zhǔn)樣品測定Ct值（圖4），并將檢測結(jié)果進(jìn)行方差分析（F檢驗(yàn)法），計算管間變異系數(shù)和批內(nèi)均勻性。根據(jù)給定的顯著性水平a與自由度，查表得臨界的Fa值，再與兩組數(shù)據(jù)計算所得的F值進(jìn)行比較。結(jié)果顯示F＜Fa，表明分裝的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在組內(nèi)與組間無明顯結(jié)果差異，均勻性良好（表3）。

圖3 不同稀釋度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 RNA2-cRNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗(yàn)結(jié)果

2.6 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性試驗(yàn)

將-80 ℃儲存的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為對照組，其他溫度下保存的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為檢測組，在不同溫度保存期結(jié)束后，隨機(jī)抽取4支進(jìn)行熒光RT-PCR試驗(yàn)測定Ct值。將每組數(shù)據(jù)分別與對照組作“雙樣本等方差假設(shè)”的t檢驗(yàn)。因各組P值均＞0.05，故其結(jié)果差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（表4），表明各檢測組在穩(wěn)定性監(jiān)測期內(nèi)是穩(wěn)定的。

表3 RNA2-cRNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗(yàn)方差分析結(jié)果

表4 RNA2-cRNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性t檢驗(yàn)統(tǒng)計結(jié)果

2.7 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值檢測與協(xié)作標(biāo)定

本次定值采用測定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度，根據(jù)片段長度換算拷貝數(shù)和協(xié)作標(biāo)定的方式，計算標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量（copies/μL）。本研究中共有8家單位參加協(xié)作標(biāo)定。參加單位采用統(tǒng)一的試驗(yàn)設(shè)計方案、實(shí)施方案和結(jié)果分析程序，分別取得3次獨(dú)立的有效結(jié)果。最終取8家單位平均值作為定值結(jié)果（表5）。

2.8 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定度

通過對實(shí)際檢測過程進(jìn)行分析，確定標(biāo)準(zhǔn)品的總不確定度，包括分析測定誤差、RNA提取中的誤差和樣本不均勻性引起的誤差。應(yīng)用A類評定方法進(jìn)行不確定度分析，經(jīng)SPSS軟件計算的RNA2-cRNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定度為0.068×108copies/μL，定值為（8.452±0.068）×108copies/μL（表5）。

表5 RNA2-cRNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果

3 討論

核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)屬于生物分子水平標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的一種，是指用于核酸擴(kuò)增技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。世界衛(wèi)生組織（WHO）1997年首次發(fā)布了用于核酸擴(kuò)增技術(shù)的核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)——丙型肝炎核酸（HCV）、乙型肝炎核酸（HBV）國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的某些疾病中應(yīng)用較成熟。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)用于動物檢疫的報道也越來越多。張桂山等[18]制備了小尾寒羊瘦素長型受體基因?qū)崟r熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒；谷強(qiáng)等[19]對新城疫病毒病毒核酸檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行了研究；吳亞瓊等[20]和孫濤等[21]分別對亞洲Ⅰ型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行了制備和研究。核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在促進(jìn)病原核酸擴(kuò)增檢測方法標(biāo)準(zhǔn)化及提高檢測一致性和準(zhǔn)確性方面發(fā)揮了重要作用。

準(zhǔn)確性、均勻性與穩(wěn)定性是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)最重要的屬性。本研究建立的RNA-cRNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可作為VNN準(zhǔn)確診斷的陽性質(zhì)控。均勻性檢驗(yàn)表明其樣品間與樣品內(nèi)無顯著差異；穩(wěn)定性檢驗(yàn)表明該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在監(jiān)測內(nèi)穩(wěn)定性良好，符合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)要求。

普通RT-PCR和熒光定量RT-PCR是OIE《水生動物疫病診斷手冊》中推薦的VNN快速診斷方法。本研究采用體外轉(zhuǎn)錄構(gòu)建基于NNV RNA2基因的RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，為VNN的特異性診斷設(shè)立了對照。在實(shí)際檢測中，該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可在擴(kuò)增檢測的逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增2個方面進(jìn)行質(zhì)量控制，符合RNA病毒檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的要求[22]。轉(zhuǎn)錄的RNA-cRNA片段無生物安全隱患，同時不易出現(xiàn)對實(shí)驗(yàn)環(huán)境和儀器造成交叉污染而導(dǎo)致的假陽性結(jié)果，具有良好的適用性。

4 小結(jié)

該定值RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為我國VNN檢測提供了技術(shù)支撐。同時，該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使得VNN診斷中不同方法、設(shè)備、試劑、人員間具有了可比性與可溯源性。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可在我國各檢驗(yàn)檢疫實(shí)驗(yàn)室及各地方水產(chǎn)技術(shù)推廣站推廣應(yīng)用，可推進(jìn)我國VNN檢測的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程。

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