王楷宬，王素春，莊青葉，邱 源

（中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032）

星狀病毒是一類無囊膜，呈球形，直徑為28～30 nm的單股正鏈RNA病毒。該病毒最早于腹瀉兒童的糞便中被發(fā)現(xiàn)。其名稱源于病毒粒子在電鏡下呈五角或六角星形[1]。本科病毒包含禽星狀病毒屬和哺乳動物星狀病毒屬。其基因組長度為6.11～7.72 kb[2]。所有星狀病毒的基因組均含3個開放閱讀框（Open reading frame，ORF），即ORFla、ORFlb和ORF2，基因組兩端為5′和3′非翻譯區(qū)（Untranslated region，UTR）。ORFla和ORFlb編碼非結(jié)構(gòu)蛋白（Nonstructural protein，NSP），ORF2編碼衣殼蛋白（Capsid protein，CP）[3]。迄今為止，對星狀病毒易感的動物多達22種。在養(yǎng)禽業(yè)中，星狀病毒通常引起幼齡個體的胃腸道疾病，可導致雞[4]、火雞[5]、珍珠雞[6]、鴨[2]、鴿子[7]和野生水禽[8]的腸炎、腎炎或病毒型肝炎等。

2011年，中國[9]和挪威[10]的研究人員均報道從鴿子中檢測到星狀病毒，并發(fā)現(xiàn)該病原屬禽腎炎病毒（Avian nephritis virus，ANV）[7]，并能引起鴿子腹瀉。Tung等[11]于2013年通過高通量測序在野鴿中檢測到星狀病毒。此后，未再見有其他關(guān)于鴿子感染星狀病毒的報道。

本實驗室于2014年在青島市的肉鴿中檢測到星狀病毒。為深入了解我國鴿群中的星狀病毒特性，采用高通量測序方法，對該毒株進行了測序和基因組分析。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

Ion PGM Template OT2 400 Kit、Ion PGM Sequencing 400 Kit V2、E-Gel SizeSelect 2%Agarose、Ion 316 Chip Kit V2、Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Beads、Qubit核酸濃度測定儀及配套試劑：購自Life technologies公司。其他設備包括：超凈工作臺（美國Forma Scientific）、移液器（Eppendorf）、孵化器（德州誠信孵化設備有限公司）、高速臺式離心機（德國Heraeus Biofuge primoR）、PCR擴增儀（Perkin Elmeter Gen Amp PCR System 9600）。

高性能計算平臺為Dell T630塔式服務器，具有2顆Intel（R）Xeon（R）CPU E5-2620 v3 @2.40 GHz；內(nèi)存264 G，存儲23 T；操作系統(tǒng)版本為 CentOS Linux release 7.1.1503（Core）。

1.2 核酸提取

2014年秋自山東省青島市某活禽交易市場肉鴿的糞便樣品中檢測到鴿星狀病毒（Pigeon/China/20/2014）[12]。將該份樣品充分混勻，高速離心和過濾，去除大分子物質(zhì)和細菌，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit（Qiagen，德國）提取病毒核酸，-80 ℃保存。

1.3 高通量測序（NGS）文庫構(gòu)建

對提取的病毒核酸，采用文獻[12]報道的方法進行NGS文庫構(gòu)建。具體方法為：在8 μL病毒RNA中，加入1 μL 100 μmol/L引物A15N6和2 μL無核酸酶的水進行混合，72 ℃ 5 min，然后將RNA引物混合物放在冰上孵育至少3 min；在 混 合 物 中， 加 入 4 μL 5×first-strand buffer、1 μL dNTP（100 μmol/L）、2 μL DTT（0.1 mol/L）、1 μL RNaseOUT ? Recombinant Ribonuclease Inhibitor（40 U/μL） 和 1 μL SuperScript? III Reverse Transcriptase（200 U/μL）（Invitrogen，USA），25 ℃ 反應15 min，42 ℃反應 30 min，70 ℃ 15 min，終止反應；在反應產(chǎn)物中，加入1 μL RNase H（TaKaRa，Japan），37 ℃ 反應 20 min； 采 用 DynaMag ? -2 Magnet 和 Agencourt?AMPure? XP Reagent（Beckman Coulter，USA）純化合成第一鏈cDNA；在純化的第一鏈cDNA中，加入引物B15N6，70 ℃ 5 min，再加入1 μL Klenow fragment（5 U）（NEB，USA）、5 μL 10×NEBuffer 2、2 μL dNTP（100 μmol/L） 和 1 μL DTT（0.1 mol/L），37 ℃反應30 min；最后采用 1×Phusion High-Fidelity Buffer、10 μmol/L 引物A30 和 B30（表1）、0.5 U Phusion High-Fidelity DNA Polymerase（NEB，USA）進行PCR擴增。將PCR產(chǎn)物采用E-Gel? SizeSelect? Agarose Gel進行電泳，篩選和回收約450 bp的擴增產(chǎn)物，將其作為NGS文庫。

表1 引物與引物序列

1.4 NGS測序

將NGS文庫稀釋為26 pmol/L；應用Ion PGM Template OT2 400 Kit，對DNA文庫進行測序前的樣品處理。將處理后的樣品加樣至Ion 316 芯片，置于PGM測序儀進行測序。

1.5 測序數(shù)據(jù)分析

對NGS測序數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控后，采用standalone NCBI BLASTn tool[13]，將測序得到的reads與GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫進行比對（E值為10～5）。由MetaGenome Analyzer（MEGAN）[14]進行 BLASTn分析結(jié)果展示；提取其中與星狀病毒序列比對上的reads，再采用CLC genomics workbench 8.5.1（Qiagen，Germany），將reads進行De Novo拼接，并分析拼接完成的基因組中的ORF；將注釋后的序列提交GenBank。

1.6 基因組特性分析

采用MEGA 6.0[15]將Pigeon/China/20/2014的全基因和3個ORF氨基酸序列，分別與GenBank中星狀病毒科代表毒株（表2）全基因和3個ORF氨基酸序列進行比對和分析，并分析這些毒株的衣殼蛋白氨基酸序列之間的遺傳距離（p-distance）。

表2 基因比較分析使用的星狀病毒毒株

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組解析

芯片上樣率為79%；測序文庫得到質(zhì)量較高的序列測序數(shù)據(jù)。CLC genomics workbench 8.5.1拼接得到的鴿星狀病毒中國分離株全基因大小為6 872 bp，GenBank登錄號為 MF768270。Pigeon/China/20/2014基因組具有與其他星狀病毒相似的結(jié)構(gòu)和基因順序，其5′端有一段非編碼區(qū)，3′端為聚A尾?；蚪M中主要包含3個ORF：ORF1a（14～3 028）編碼1 005個氨基酸的多肽；ORF1b（3 028～4 554）編碼509個氨基酸RNA依賴的RNA多聚酶；ORF2（4 573～6 594）編碼674個氨基酸的衣殼蛋白。3′端（6 677～6 711）具有1個保守的莖環(huán)樣模體（s2m）。有研究推測，該模體與病毒轉(zhuǎn)錄機制有關(guān)，在啟動蛋白質(zhì)合成過程中起重要作用。在ORF1a和ORF1b 重合區(qū)域存在1個核糖體移碼序列（RFS）。該序列具有AAAAAAC特征（3 025～3 011）。

2.2 基因組比較分析

Pigeon/China/20/2014與15株禽星狀病毒代表性毒株（表2）衣殼蛋白氨基酸序列的進化分析結(jié)果見圖1；各毒株衣殼蛋白氨基酸序列之間的p-distance分析結(jié)果見圖2。衣殼蛋白氨基酸序列進化分析結(jié)果顯示，Pigeon/China/20/2014與2003年分離自挪威的野生鴿03/594-9親緣關(guān)系最近（2011年報道）。按照國際病毒分類委員會（ICTV）第9次病毒分類報告中的星狀病毒科分類標準，可將這些禽星狀病毒分為兩個基因群。所有鴿源星狀病毒均屬于Group Ⅰ。該基因群還包含從雞群分離的禽腎炎病毒（圖3），且不再分基因型。而GroupⅡ包含兩個基因型（Group ⅡA 和 Group ⅡB），鴨、鵝和火雞的星狀病毒分離株均屬此基因群。

圖1 星狀病毒衣殼蛋白（ORF2）氨基酸序列進化分析

圖2 Pigeon/China/20/2014與星狀病毒代表毒株衣殼蛋白氨基酸序列p-distance分析

Pigeon/China/20/2014與2003年分離自挪威的野生鴿03/594-9親緣關(guān)系最近。全基因組進化分析結(jié)果見圖3。

其與野生鴿分離的3株星狀病毒（03/594-5、03/594-6和03/594-9）的親緣關(guān)系較近，而與野生鴿分離的這3株星狀病毒同源性更高。ORF1b進化分析結(jié)果見圖4。

因從野生鴿中分離的3株星狀病毒和從林鴿中分離的病毒缺少此基因序列，所以Pigeon/China/20/2014與ANV和PeANV親緣關(guān)系較近。ORF1a進化分析結(jié)果見圖5。

圖3 星狀病毒全基因進化分析

圖4 星狀病毒RNA 依賴的RNA多聚酶（ORF1b）氨基酸序列進化分析

圖5 星狀病毒ORF1a氨基酸序列進化分析

3 討論

星狀病毒能引起禽的腸炎，并增大幼齡火雞、雞、鵝的死亡率，或者引起雞的腎炎和鴨的致死性肝炎[16]。本文對從我國華東地區(qū)活禽交易市場售賣的肉鴿中分離的1株星狀病毒基因組進行了分析，發(fā)現(xiàn)該毒株屬于Group Ⅰ基因群的禽星狀病毒，且與2003年挪威野生鴿分離株（03/594-9）親緣關(guān)系最近，與2011年我國分離的鴿源星狀病毒（SH10）親緣關(guān)系較遠。挪威分離株（03/594-9）分離自2003年的野生鴿樣品，且發(fā)表的文章僅報道了該毒株的部分基因組[10]。歷經(jīng)10余年，在我國活禽市場又檢測到與此相似的病毒。這可能是由于國際貿(mào)易引起的。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的動物貿(mào)易檢疫名錄中，未涉及星狀病毒，因此攜帶該病原的鴿子通過國際貿(mào)易引入我國的可能性極大，也不排除通過跨國境賽鴿比賽逐步擴散到我國的可能。我國2011年分離的鴿源星狀病毒（SH10）與雞源的禽腎炎病毒親緣關(guān)系較近。而本文報道的鴿源星狀病毒與2011年分離株不同，說明我國鴿群中感染的星狀病毒較為多樣。我國雖然對鴨源星狀病毒研究較多，但本文分離的Pigeon/China/20/2014與3株鴨源星狀病毒衣殼蛋白的平均氨基酸遺傳距離（p-distance）在0.735～0.756之間，差異較大。

星狀病毒分為禽星狀病毒屬和哺乳動物星狀病毒屬。ICTV第9次病毒分類報告中星狀病毒科的分類標準為：在氨基酸水平上對完整的衣殼蛋白進行遺傳分析；兩個基因組之間衣殼蛋白的平均氨基酸遺傳距離（p-distance）在0.204～0.284之間，同一個基因型氨基酸遺傳距離范圍在0.576～0.741之間。本文對各種禽類感染的禽星狀病毒屬病毒進行了基因分析。按照以上標準，本文分析的禽星狀病毒主要可分為兩個基因群（Group Ⅰ 和GroupⅡ），Group Ⅱ又分為兩個基因型（Group ⅡA 和Group ⅡB）。Group Ⅰ基因群中的星狀病毒宿主為雞和鴿；Group Ⅱ基因群中的星狀病毒宿主為鴨、鵝和火雞。衣殼蛋白是星狀病毒的表面蛋白。分析結(jié)果顯示該蛋白可能與宿主嗜型有關(guān)，但其機制還需進一步研究證實。

綜上所述，本文報道了我國第2株鴿群星狀病毒全基因，為禽源星狀病毒的進一步分類提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，有利于了解我國流行的鴿星狀病毒特性。

[1] MADELEY C R，COSGROVE B P. Letter：28 nm particles in faeces in infantile gastroenteritis [J]. Lancet，1975，2（7932）：451-452.

[2] FU Y，PAN M，WANG X，et al. Complete sequence of a duck astrovirus associated with fatal hepatitis in ducklings [J]. Journal of general virology，2009，90（5）：1104-1108.

[3] MONROE S S，JIANG B，STINE S E，et al.Subgenomic RNA sequence of human astrovirus supports classification of Astroviridae as a new family of RNA viruses [J]. Journal of virology，1993，67（6）：3611-3614.

[4] KANG K I，ICARD A H，LINNEMANN E，et al.Determination of the full length sequence of a chicken astrovirus suggests a different replication mechanism [J].Virus genes，2012，44（1）：45-50.

[5] KOCI M D，SEAL B S，SCHULTZ-CHERRY S.Molecular characterization of an avian astrovirus [J].Journal of virology，2000，74（13）：6173-6177.

[6] CANELLI E，CORDIOLI P，BARBIERI I，et al.Astroviruses as causative agents of poultry enteritis：genetic characterization and longitudinal studies on field conditions [J]. Avian diseases，2012，56（1）：173-182.

[7] ZHAO W，ZHU A L，YU Y，et al. Complete sequence and genetic characterization of pigeon avian nephritis virus，a member of the family Astroviridae [J]. Archives of virology，2011，156（9）：1559-1565.

[8] CHU D K，LEUNG C Y，PERERA H K，et al. A novel group of avian astroviruses in wild aquatic birds [J].Journal of virology，2012，86（24）：13772-13778.

[9] ZHAO W，ZHU A L，YUAN C L，et al. Detection of astrovirus infection in pigeons（Columbia livia）during an outbreak of diarrhoea [J]. Avian pathol，2011，40（4）：361-365.

[10] KOFSTAD T，JONASSEN C M. Screening of feral and wood pigeons for viruses harbouring a conserved mobile viral element：characterization of novel Astroviruses and Picornaviruses [J]. PLos one，2011，6（10）：e25964.

[11] PHAN T G，VO N P，BOROS A，et al. The viruses of wild pigeon droppings [J]. PLos one，2013，8（9）：e72787.

[12] QIU Y，CHEN J M，WANG T，et al. Detection of viromes of RNA viruses using the next generation sequencing libraries prepared by three methods [J]. Virus research，2017，237：22-26.

[13] MCGINNIS S，MADDEN T L. BLAST：at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools [J].Nucleic acids research，2004，32：20-25.

[14] HUSON D H，AUCH A F，QI J，et al. MEGAN analysis of metagenomic data [J]. Genome research，2007，17（3）：377-386.

[15] TAMURA K，STECHER G，PETERSON D，et al.MEGA6：Molecular evolutionary genetics analysis version 6.0 [J]. Molecular biology and evolution，2013，30（12）：2725-2729.

[16] CATTOLI G，DE BATTISTI C，TOFFAN A，et al.Co-circulation of distinct genetic lineages of astroviruses in turkeys and guinea fowl [J]. Archives of virology，2007，152（3）：595-602.