楊 勇,龍 悅,吳志明,夏 薇,李昆太*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045；2.江西派尼生物藥業(yè)有限公司，江西 安義 330500)

維生素B12(Vitamin B12)又稱(chēng)鈷胺素，通常用來(lái)表示含鈷離子的類(lèi)咕啉(corrinoid)化合物，最早作為“抗惡性貧血因子”在1926年發(fā)現(xiàn)。作為一種重要的生理活性物質(zhì)，維生素B12是許多重要生物化學(xué)反應(yīng)所必需的輔酶，如分子內(nèi)重排作用、由三磷酸核糖核苷酸生成2′-三磷酸脫氧核糖核苷酸的還原反應(yīng)、分子間甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)等[1]。

由于維生素B12的分子結(jié)構(gòu)極為復(fù)雜，其全化學(xué)合成需要多達(dá)70余個(gè)的反應(yīng)步驟[2]，且成本昂貴，故目前幾乎都是通過(guò)微生物發(fā)酵的方式來(lái)生產(chǎn)維生素B12。而具備維生素B12合成能力的微生物有很多種，但目前成功應(yīng)用于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)維生素B12的菌株主要有費(fèi)氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreudenreichii)、謝氏丙酸桿菌(Propionibacteriumshermanii)和脫氮假單胞桿菌(Pseudomonasdenitrificans)等[3]。其中，脫氮假單胞桿菌更是因?yàn)槠渚S生素B12產(chǎn)率高，而成為當(dāng)前應(yīng)用最廣的維生素B12生產(chǎn)菌株。尤其是通過(guò)一系列發(fā)酵工藝的優(yōu)化，脫氮假單胞桿菌的維生素B12工業(yè)化發(fā)酵水平近年來(lái)得到了大幅度的提高，穩(wěn)定在200 mg/L以上[4]。

并且經(jīng)過(guò)幾十年研究，脫氮假單胞桿菌中維生素B12生物合成途徑已經(jīng)得到闡明[5-7]。Wang等[8]利用13C同位素標(biāo)記代謝流分析的方法考察了維生素B12產(chǎn)生菌脫氮假單胞桿菌的中心代謝網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)糖酵解途徑(EMP途徑)的代謝活性很低，主要利用ED途徑分解代謝葡萄糖，并且存在較大通量的磷酸戊糖途徑(HMP途徑)。有文獻(xiàn)[9-10]報(bào)道檸檬酸鈉結(jié)合葡萄糖代謝能阻止微生物發(fā)酵過(guò)程中副產(chǎn)物的合成，檸檬酸鈉作用于微生物發(fā)酵的探究也逐漸深入。劉新星等[11]和陳雙喜等[12]發(fā)現(xiàn)檸檬酸鈉能減弱丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶的活性，并能抑制EMP途徑和TCA循環(huán)之間的“碳源溢流”，增加HMP途徑的通量，大幅度提高肌苷產(chǎn)量。隨后，大量的文獻(xiàn)[13-16]報(bào)道，添加檸檬酸鈉能在不影響菌體正常生長(zhǎng)的情況下，減少發(fā)酵副產(chǎn)物的生成，改變目標(biāo)產(chǎn)物合成途徑關(guān)鍵點(diǎn)的代謝流分布，提高目標(biāo)產(chǎn)物合成途徑的代謝流量，提高胞內(nèi)NADPH、NADH和ATP的水平，促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物的合成和積累。

因此，本文通過(guò)搖瓶培養(yǎng)的方式，結(jié)合酶學(xué)方法，從發(fā)酵液pH、菌體生長(zhǎng)量、維生素B12產(chǎn)量、有機(jī)酸含量和糖代謝途徑的關(guān)鍵酶活力等角度出發(fā)，考察了不同濃度的檸檬酸鈉對(duì)脫氮假單胞桿菌發(fā)酵過(guò)程的影響，并總結(jié)出添加濃度為0.3%的檸檬酸鈉最有利于脫氮假單胞桿菌發(fā)酵產(chǎn)維生素B12。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種 脫氮假單胞桿菌(Pseudomonasdenitrificans)，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 藥品和儀器 乙酰輔酶A、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、醛縮酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和L-乳酸脫氫酶均為Sigma產(chǎn)品，DNA酶、草酰乙酸、磷酸烯醇丙酮酸、ATP、ADP、NADP、NADH、NADPH均為進(jìn)口分裝生化試劑，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

UV765型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精科)；ZHWY-2112型大振幅恒溫雙層搖床(上海智誠(chéng))；高效液相色譜儀SPD-20A(MODEL)；雷磁pHS-3C pH計(jì)(上海精科)。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面培養(yǎng)基 蔗糖30 g，蛋白胨10 g，玉米漿10 g，(NH4)2SO40.25 g，(NH4)2HPO41.5 g，MnSO4·H2O 0.1 g，ZnSO4·7H2O 0.1 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL。滅菌前調(diào)pH 至7.0～7.2。

1.2.2 種子培養(yǎng)基 蔗糖35 g，蛋白胨20 g，KH2PO45 g，(NH4)2SO42.0 g，(NH4)2HPO40.8 g，MgSO41.5 g，ZnSO4·7H2O 0.02 g，MnSO4·H2O 0.2 g，去離子水1 000 mL。滅菌前調(diào)pH至 7.2～7.4。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基 蔗糖50 g，蛋白胨25 g，(NH4)2SO41 g，ZnSO4·7H2O 0.08 g，MgSO42 g，KH2PO40.8 g，甜菜堿10 g，5,6-二甲基苯并咪唑(DMBI)0.08 g，CoCl2·6H2O 0.15 g，CaCO32 g，去離子水1 000 mL。滅菌前調(diào)pH至 7.2～7.4。

1.3 搖瓶發(fā)酵方法

種子液的制備：每支培養(yǎng)好的脫氮假單胞桿菌新鮮斜面(18 mm×180 mm)加入10 mL無(wú)菌水，刮洗制備成菌懸液。以無(wú)菌吸管吸取2 mL菌懸液至裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶(裝量為50 mL/250 mL三角瓶)中，在搖床上進(jìn)行種子液的培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度30 ℃；轉(zhuǎn)速180 r/min；培養(yǎng)至OD700為9～10(周期大概24 h)。

搖瓶發(fā)酵：培養(yǎng)好的種子液按10%接種量接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶(裝量為40 mL/250 mL三角瓶)中，在30 ℃的溫度和180 r/min的轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)。

將檸檬酸鈉按照相應(yīng)的濃度梯度(濃度梯度為0%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%)添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。

1.4 酶液的制備

取5 mL發(fā)酵液于4 ℃，4 000 r/min離心20 min，沉淀用5 mL磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.0) 充分混勻后在上述相同條件下離心，棄上清繼續(xù)用PBS清洗再離心。上述處理后的沉淀中加入5 mL PBS，DNA酶(2.5 mg/mL) 25 μL，溶菌酶(25 mg/mL) 300 μL，充分混勻在30 ℃水浴振蕩30 min，于4 ℃ 8 000 r/min離心20 min，上清即為細(xì)胞裂解液[11]。

1.5 測(cè)定方法

1.5.1 菌體生物量的測(cè)定 將取樣的發(fā)酵液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯?，?00 nm處測(cè)定吸光值，用蒸餾水作為對(duì)照，試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。菌體的光密度(OD700)=OD讀數(shù)×稀釋倍數(shù)。

1.5.2 維生素B12含量的測(cè)定 取30 mL充分搖勻的發(fā)酵液于4 000 r/min離心10 min，去上清后加30 mL蒸餾水?dāng)噭蛟谏鲜鱿嗤瑮l件下離心，倒去上清液后加入10 mL蒸餾水將菌體攪勻，加入8%(質(zhì)量比)亞硝酸鈉溶液和冰乙酸各3 mL，搖勻，于95～100 ℃水浴30 min；水浴后冷卻至室溫，加蒸餾水定容至50 mL，過(guò)濾。所得濾液適當(dāng)稀釋后，在波長(zhǎng)為361 nm處進(jìn)行紫外光譜分析，根據(jù)所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)算出維生素B12含量[3]，試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.5.3 酶液中蛋白的測(cè)定 酶液中蛋白的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[17]。

1.5.4 酶活的測(cè)定 (1)葡萄糖激酶：采用6-磷酸葡萄糖脫氫酶偶聯(lián)比色法[18]，1 mL反應(yīng)體積中含有50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)，1 mmol/L ATP，0.5 mmol/L NADP，10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L葡萄糖和0.7U 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。

(2)丙酮酸激酶：參照文獻(xiàn)[19]并做了部分修改，1 mL反應(yīng)體積中含有2 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸，5 mmol/L ADP，2 mmol/L果糖-1,6-二磷酸，0.15 mmol/L NADH，80 mmol/L KCl，10 mmol/L MgCl2和2.85 U L-乳酸脫氫酶。

(3)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶：參照文獻(xiàn)[20]并做了部分修改，1 mL反應(yīng)體積中含有2 mmol/L葡萄糖-6-磷酸，1 mmol/L NADP和10 mmol/L MgCl2。

(4)磷酸果糖激酶：采用酶偶聯(lián)法[21]，1 mL反應(yīng)體積中含有2 mmol/L果糖-6-磷酸，1 mmol/L ATP，0.3 mmol/L NADH，10 mmol/L MgCl2，1 U醛縮酶，3.5 U磷酸丙糖異構(gòu)酶和1 U甘油醛-3-磷酸脫氫酶。

(5)檸檬酸合成酶：參照文獻(xiàn)[22]并做了部分修改，1 mL反應(yīng)體積中含有1 mmol/L 2-硝基苯甲酸(DTNB)，0.5 mmol/L乙酰輔酶A，10 mmol/L草酰乙酸和10 mmol/L MgCl2。

葡萄糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的酶活測(cè)定時(shí)，1 mL反應(yīng)體系和50 μL細(xì)胞裂解液分別在30 ℃水浴鍋中預(yù)熱5 min，混合后立即連續(xù)測(cè)定340 nm處吸光值10 min，△A值=反應(yīng)10 minA340值-反應(yīng)0 minA340值，根據(jù)所繪制的NADPH標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)算出酶量。

丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶的酶活測(cè)定時(shí)，1 mL反應(yīng)體系和50 μL細(xì)胞裂解液分別在30 ℃水浴鍋中預(yù)熱5 min，混合后立即連續(xù)測(cè)定340 nm處吸光值10 min，△A值=反應(yīng)0 minA340值-反應(yīng)10 minA340值，根據(jù)所繪制的NADH標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)算出酶量。

檸檬酸合成酶的酶活測(cè)定時(shí)，1 mL反應(yīng)體系和50 μL細(xì)胞裂解液分別在30 ℃水浴鍋中預(yù)熱5 min，混合后立即連續(xù)測(cè)定412 nm處吸光值10 min，△A值=反應(yīng)10 minA340值-反應(yīng)0 minA340值，根據(jù)公式A=εbc算出酶量，摩爾吸光系數(shù)ε=1 485 L/(mol·cm)。

一個(gè)酶活力單位(U)定義為在30 ℃下，1分鐘催化1 μmol的底物反應(yīng)所需的酶量。根據(jù)各樣品的蛋白質(zhì)含量，計(jì)算出酶的比活力(比活力代表的是添加檸檬酸鈉與不添加檸檬酸鈉對(duì)照酶活下的比值)。

1.5.5 有機(jī)酸的測(cè)定 采用HPLC法，色譜條件：色譜柱 Hi-Plex H(8 μm，300 mm×7.8 mm)，流動(dòng)相0.01 M H2SO4，流速 0.4 mL/min，樣品量 10 μL，溫度 50 ℃，檢測(cè)器 UV 210 nm。標(biāo)準(zhǔn)品為檸檬酸、延胡索酸、乙酸、丙酮酸、蘋(píng)果酸、琥珀酸、草酰乙酸、α-酮戊二酸和丙酸。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬酸鈉對(duì)脫氮假單胞桿菌發(fā)酵過(guò)程基本參數(shù)的影響

不同濃度的檸檬酸鈉對(duì)菌體發(fā)酵過(guò)程基本參數(shù)的影響如圖1所示。其中A、B、C 3圖分別表示菌濃、pH以及維生素B12變化曲線(xiàn)。從圖中可以看出，發(fā)酵前72 h的菌體生長(zhǎng)速度隨著檸檬酸鈉添加濃度的增大而明顯增加，這表明檸檬酸鈉的添加有助于P.denitrificans的菌體生長(zhǎng)；另外，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中的檸檬酸鈉添加濃度為0.3%和0.4%時(shí)，其維生素B12發(fā)酵產(chǎn)量明顯高于未添加檸檬酸鈉的發(fā)酵處理，產(chǎn)量分別高達(dá)45.73 μg/mL和50.44 μg/mL，這表明檸檬酸鈉對(duì)產(chǎn)物合成具有一定的促進(jìn)作用；進(jìn)一步測(cè)定了發(fā)酵過(guò)程的pH變化情況，結(jié)果顯示檸檬酸鈉有助于維系發(fā)酵液的pH保持在合理水平，盡管0.3%和0.4%檸檬酸鈉添加方案下的菌體生長(zhǎng)較為迅速，但是其整個(gè)發(fā)酵過(guò)程的pH卻一直穩(wěn)定在6.5～7.0，而其他發(fā)酵方案的pH出現(xiàn)了明顯的下降趨勢(shì)。

綜合以上結(jié)果可以得出結(jié)論，發(fā)酵培養(yǎng)基中添加質(zhì)量濃度為0.3%～0.4%的檸檬酸鈉不僅有利于P.denitrificans的菌體生長(zhǎng)和維生素B12合成，而且還對(duì)發(fā)酵液的pH具有較強(qiáng)的緩沖作用，使得整個(gè)發(fā)酵過(guò)程的pH一值保持在較合理的水平。

圖1 檸檬酸鈉脫氮假單胞桿菌發(fā)酵過(guò)程基本參數(shù)的影響Fig.1 The effects of sodium citrate on basic parameters of Pseudomonas denitrificans fermentation

2.2 檸檬酸鈉對(duì)有機(jī)酸代謝的影響

為了進(jìn)一步研究檸檬酸鈉對(duì)脫氮假單胞桿菌代謝過(guò)程的影響，在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入質(zhì)量濃度為0%和0.3%的檸檬酸鈉，測(cè)定這2種發(fā)酵方案下有機(jī)酸動(dòng)態(tài)變化情況。

由圖2可知在脫氮假單胞桿菌發(fā)酵過(guò)程中，檸檬酸、延胡索酸、琥珀酸和蘋(píng)果酸是主要的有機(jī)酸代謝物。檸檬酸鈉的添加明顯促進(jìn)了發(fā)酵前期檸檬酸濃度積累。而隨著發(fā)酵的進(jìn)行，這2種發(fā)酵處理的檸檬酸濃度均呈明顯的下降趨勢(shì)。然而，當(dāng)培養(yǎng)基中未添加檸檬酸鈉時(shí)，其檸檬酸濃度反而顯著高于0.3%檸檬酸鈉添加量下的處理。這說(shuō)明檸檬酸鈉的添加會(huì)抑制檸檬酸的生成。在發(fā)酵前中期添加檸檬酸鈉后，延胡索酸濃度升高，而發(fā)酵后期未添加檸檬酸鈉的發(fā)酵處理略高。因此，檸檬酸鈉的添加會(huì)促進(jìn)延胡索酸的生成。但無(wú)論是否添加檸檬酸鈉，蘋(píng)果酸濃度在前36 h相差不大，但是此后未添加檸檬酸鈉的發(fā)酵過(guò)程的蘋(píng)果酸濃度則顯著高于0.3%檸檬酸鈉添加量的發(fā)酵處理，二者含量在72 h時(shí)相差達(dá)60 mmol/L。這說(shuō)明檸檬酸鈉的添加會(huì)促進(jìn)蘋(píng)果酸的消耗。在發(fā)酵前48 h，未添加檸檬酸鈉處理下的琥珀酸濃度明顯更高，在發(fā)酵后期這2種發(fā)酵處理的琥珀酸濃度相差不大。因此，檸檬酸鈉的添加會(huì)抑制琥珀酸的生成。

2.3 檸檬酸鈉對(duì)糖代謝途徑中關(guān)鍵酶活力的影響

以不添加檸檬酸鈉的發(fā)酵處理為對(duì)照，考察了添加0.1%和0.3% 2種質(zhì)量濃度下菌體糖代謝途徑中關(guān)鍵酶的相對(duì)比酶活力。其結(jié)果如圖3所示，其中a、b、c、d和e圖分別表示葡萄糖激酶、丙酮酸激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、磷酸果糖激酶和檸檬酸合酶相對(duì)比活力。

圖2 檸檬酸鈉對(duì)有機(jī)酸代謝的影響Fig.2 The effects of sodium citrate on the metabolism of organic acids

*The ratio between the enzyme activity with sodium citrate addition and the enzyme activity without sodium citrate addition圖3 糖代謝途徑關(guān)鍵酶相對(duì)比活的時(shí)序變化Fig.3 Relative specific activity of key enzymes in glucose metabolism pathway

從圖3可以看出，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，添加了檸檬酸鈉后葡萄糖激酶的活力沒(méi)有明顯的變化，且添加與未添加檸檬酸鈉這兩者的酶活力相近，比值都在1上下略微波動(dòng)，始終保持著較大的酶活力，說(shuō)明檸檬酸鈉對(duì)葡萄糖激酶的影響不大。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，添加了檸檬酸鈉后丙酮酸激酶的活力變化很明顯。在發(fā)酵初期，添加檸檬酸鈉后丙酮酸激酶的活力較大，比未添加時(shí)增加了35%。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，其酶活力開(kāi)始下降，且低于未添加檸檬酸鈉時(shí)的相對(duì)比活力，最低的僅有接近70%，同比發(fā)酵初期降低了接近60%。隨著葡萄糖的濃度增加，檸檬酸鈉開(kāi)始降低丙酮酸激酶的活力，且較高濃度的檸檬酸鈉對(duì)丙酮酸激酶的抑制作用更強(qiáng)。

c為0.1%和0.3% 2種檸檬酸鈉添加質(zhì)量濃度下，其發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的相對(duì)比酶活力時(shí)序變化。從圖中可看出，添加檸檬酸鈉后對(duì)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的活力有一定的影響，并從圖中可以看出，在菌體生長(zhǎng)和維生素B12合成的開(kāi)始階段，檸檬酸鈉提高了葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的活力。從d圖不同時(shí)間相對(duì)酶活數(shù)據(jù)分析，添加檸檬酸鈉后明顯降低了磷酸果糖激酶的活性。除此之外，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，檸檬酸鈉濃度為0.3%的酶活力低于濃度為0.1%的處理，說(shuō)明檸檬酸鈉對(duì)磷酸果糖激酶有強(qiáng)烈的抑制作用，且檸檬酸鈉的濃度越大，抑制作用越強(qiáng)。與磷酸果糖激酶的酶活力變化趨勢(shì)相類(lèi)似，添加檸檬酸鈉的檸檬酸合成酶酶活力出現(xiàn)了明顯的下降，相對(duì)比活最大減少了70%。而且檸檬酸鈉的添加濃度越高，其檸檬酸合成酶酶活力越低。由此可見(jiàn)，檸檬酸鈉對(duì)檸檬酸合成酶的酶活力具有一定的抑制作用，這與前面添加檸檬酸鈉會(huì)抑制檸檬酸的生成相一致。

3 結(jié)論與討論

由于維生素B12的化學(xué)結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，合成過(guò)程高度繁瑣。使得應(yīng)用化學(xué)方法來(lái)工業(yè)化生產(chǎn)維生素B12在技術(shù)上存在很大的難度，成本十分昂貴。而在脫氮假單胞桿菌發(fā)酵產(chǎn)維生素B12過(guò)程中，添加一些維生素B12合成所必需的化合物是非常必要的。例如鈷離子和5,6-二甲基苯并咪唑[23]。另外，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加甘氨酸、蘇氨酸、5-氨基乙酰丙酸、甜菜堿和膽堿等甲基供體，也能促進(jìn)維生素B12的合成[24]，特別是膽堿能增加膜透性[3]。除此之外，不同的無(wú)機(jī)氮源對(duì)P.denitrificans代謝產(chǎn)維生素B12的影響也是不一樣的，彭衛(wèi)福等[25]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，硫酸銨是維生素B12發(fā)酵較為適宜的無(wú)機(jī)氮源，高濃度的NH4+能明顯促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)，但是會(huì)對(duì)維生素B12的合成產(chǎn)生一定的負(fù)作用。

為了進(jìn)一步闡明檸檬酸鈉添加對(duì)P.denitrificans代謝途徑所產(chǎn)生的影響，研究發(fā)酵過(guò)程有機(jī)酸和糖代謝途徑關(guān)鍵酶酶活力的時(shí)序性動(dòng)態(tài)變化發(fā)現(xiàn)：在TCA循環(huán)中，琥珀酸是由琥珀酰CoA水解生成，而琥珀酰CoA是脫氮假單胞桿菌合成維生素B12的重要前體物質(zhì)。由此可見(jiàn)，檸檬酸鈉抑制琥珀酸的生成，可能會(huì)使得大量的琥珀酰CoA得以流向維生素B12合成途徑。另外，檸檬酸鈉促進(jìn)蘋(píng)果酸的快速利用，產(chǎn)生大量的還原力NADH，更好地滿(mǎn)足了維生素B12合成所需。本文所測(cè)定的5個(gè)酶均為代謝網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵酶，根據(jù)Wang等[8]的研究結(jié)果，并結(jié)合前文中維生素B12合成量分析推測(cè)，在脫氮假單胞桿菌中心代謝途徑中存在較大通量的HMP途徑，這可能是HMP途徑為菌體生長(zhǎng)提供大量的前體代謝物，而較高濃度的檸檬酸鈉提高了葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的活力，從而提高了HMP途徑的通量，為維生素B12的合成提供了大量的NADPH，故維生素B12產(chǎn)量大幅度增加。此外，由于檸檬酸鈉與葡萄糖的聯(lián)合作用增加了細(xì)胞內(nèi)磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的濃度，而PEP是磷酸果糖激酶的強(qiáng)烈抑制劑[26]，而磷酸果糖激酶的活力受高濃度ATP的抑制[6]，檸檬酸鈉增強(qiáng)了ATP對(duì)磷酸果糖激酶的抑制作用，因此減緩了糖酵解途徑的速率。TCA循環(huán)中，檸檬酸合成酶的活力也受到了一定的限制作用。由此可見(jiàn)，檸檬酸鈉的添加可增加P.denitrificans中HMP途徑的代謝通量，而這可為維生素B12的合成提供充足的還原力NADPH，從而有利于維生素B12發(fā)酵產(chǎn)量的提高。

綜上所述，檸檬酸鈉的添加提高了胞內(nèi)ATP的含量，增加了HMP途徑的代謝通量，降低了EMP和TCA循環(huán)的代謝流量，為維生素B12的合成提供充足的還原力NADPH，有利于維生素B12產(chǎn)量的提高。

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