林 艷，黃少偉，毛積鵬，何紫迪，蔣開彬

(華南農(nóng)業(yè)大學 廣東省森林植物種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用重點實驗室/林學與風景園林院，廣東 廣州 510462)

在以鋸材為生產(chǎn)目的的人工林培育中，材性性狀作為重要的經(jīng)濟性狀已受廣泛重視。對木材材性的重視，一方面源于它們對出材率，對最終產(chǎn)品的質(zhì)量和市場價格影響重大[1]，另一方面也因為它們受中度至高度的遺傳控制[2-3]，對這些性狀的改良能獲得較大的遺傳增益。已經(jīng)開展定位數(shù)量性狀基因位點定位(quantitative trait locus,QTL)的性狀包括：生長與活力[4]、木材性狀[5]、油成分[6]、無性繁殖特性[7]、分枝習性和生理性狀等[8-9]。

林木生長周期長，世代周轉(zhuǎn)慢，雜合性強，絕大多數(shù)重要的經(jīng)濟性狀為數(shù)量性狀，受環(huán)境影響大，多數(shù)性狀的遺傳控制，如基因的數(shù)目、基因位點和作用效果等，都還不清楚[10]，而分子生物學技術(shù)為解決這些問題提供了一個有力的工具。通過構(gòu)建高密度遺傳圖譜，建立性狀與分子標記的連鎖，進而確定控制性狀的基因數(shù)目、效應值以及基因間的相互作用，可大大提高林木育種的研究水平，因此，構(gòu)建林木遺傳圖譜和定位數(shù)量性狀基因位點具有重要的理論和實踐意義[11]。

50年代澳大利亞昆士蘭林業(yè)研究所首次開展了濕地松與加勒比松雜交育種,取得了舉世矚目的成就。我國于60年代初開展?jié)竦厮?、加勒比松雜交育種工作，取得了顯著的經(jīng)濟、社會效益[12]。傳統(tǒng)的林木遺傳改良方法是通過雜交育種試驗，育種周期長，具有一定局限性，分子標記輔助育種的出現(xiàn)大大縮短了育種周期，目前已有研究人員通過RAPD[13]、SSR[14]等分子標記技術(shù)構(gòu)建濕加松遺傳圖譜，但利用遺傳圖譜進行QTL定位分析的較少。對濕加松材性性狀的QTL定位研究，有助于確定該性狀受遺傳控制的程度，促進雜種松的遺傳改良進展。

本研究采用的親本樹種加勒比松(Pinuscaribaea)具有速生性和優(yōu)良的分枝習性的特性，濕地松(Pinuselliottii)具有干形的通直性和較高的木材密度的特性，濕地松×加勒比松雜種多個重要經(jīng)濟性狀的表現(xiàn)具有明顯的樹種效應[15]。此外，松樹的生殖生物學具有獨特之處，其種子具有比較大的單倍體胚乳，可以利用一個單株的大配子體群體構(gòu)建單株樹遺傳圖譜，這一策略已在多種松樹上得到應用[16]。

1 材料與方法

1.1 材 料

以濕地松(Pinuselliottiivar.elliottii，PEE)為母本，加勒比松(Pinuscaribaeavar.hondurensis，PCH)為父本，將PEE的一個無性系(2ee1-102)和PCH的一個無性系(1ch1-063)人工控制授粉。雜交種子全部播種育苗，營造試驗林，地點在澳大利亞昆士蘭(Queensland)東南部的Beerburrum(26°09′S，152°53′E)和Tuan(25°22′S，152°30′E)。選擇雜交F1代共86株用于本試驗作圖群體及木材密度QTL定位群體。

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取與濃度檢測 從上述兩個試驗點的86株樹上采集松針，采用Graham等人[17]的方法提取DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用紫外分光光度計測其濃度和純度，將DNA濃度調(diào)整至30～40g/g[18]，-20 ℃低溫保存。

1.2.2 SSR、AFLP、ESTP和PAL1標記與遺傳圖譜的構(gòu)建 參照Shepherd等[19]成功轉(zhuǎn)移到PEE和PCH的201個SSR標記，選擇擴增效果較好的137對引物用于多態(tài)性檢測。連同單核苷酸多態(tài)性(SNP)技術(shù)標定的一個苯丙氨酸脫氨酶(PAL1)基因和Shepherd等[20]發(fā)表的297個AFLP標記，最后采用JoinMap?3.0[21]作圖軟件構(gòu)建連鎖遺傳圖譜。

1.2.3 木材密度的測量 在6 a生濕加松86個單株樹干胸高位置以下的輪枝間(約1.2 m)鉆取直徑12 mm的木芯備用。將木芯置于索氏抽提器中，分別用酒精和水各抽提6 h和8 h去除松脂，然后置于103 ℃烘箱烘干，在槽形支架上粘牢，沿徑向鋸成(2.00±0.05)mm厚的薄片，將薄片放置在室內(nèi)使其含水率與空氣濕度達到平衡，以便進行X光照射。

對所有個體進行木材密度分析，采用間接的X射線光密度法掃描，產(chǎn)生數(shù)碼圖像，用WindendroTM軟件[22]進行分析。通過對X射線密度的原始數(shù)據(jù)進行檢驗，發(fā)現(xiàn)最外一個年輪的晚材在處理過程中受損或在WinDendro軟件分析過程中判讀不準確，另外由于每個樣本髓心與木芯取樣位置的距離都不完全相等，導致第一個年輪數(shù)據(jù)不準確,因此第一年和第六年年輪數(shù)據(jù)舍棄，采用QTL定位法對4年的年輪密度：全木芯木材基本密度(BD)(單位：mg/c3),年輪木材密度(RD),早材基本密度(EWD),晚材基本密度(LWD)進行測量并求平均值。

1.2.4 QTL定位方法 用作圖軟件MapQTL 4.0?[23]進行木材密度QTL定位，采用單標記作圖法(MT)，和區(qū)間作圖法(IM)進行QTL分析，以LOD值的大小來判斷是否存在QTL效應。

圖1 加勒比松父本的遺傳圖譜Fig.1 Genetic map of male parent of Pinus caribaea

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

加勒比松圖譜共包含199個標記：70個SSR,125個AFLP,3個ESTP和PAL1，分成32個連鎖群(Pc1～Pc32，其中Pc3和Pc6因無法確定連鎖相，各分成兩個片段，實際上是34個連鎖群)，總長度為1 734 cM,標記平均間距(10.6±7.8)cM(圖1)。

2.2 分子標記與木材密度QTL的連鎖

全木芯木材基本密度(BD)和年輪平均木材密度(AVRD)上都有數(shù)量較大的QTL位點，如BD，在Kruskal-Willas檢驗和區(qū)間作圖中顯著性水平都高于0.05的位點有8個，分布在連鎖群H1_Pc16,H2_Pc7和H14_Pc21上(表1)。AVRD上效應較高的位點，也主要分布在3個連鎖群，分別是H2_Pc7,H2_Pc10和H14_Pc21(表2)。

表1 分子標記與全木芯木材基本密度(BD)QTL的連鎖

結(jié)果顯示，全木芯木材基本密度(BD)和年輪平均木材基本密度(AVRD)都存在解釋表型方差在20%以上的點，并且多數(shù)分布在連鎖群H2_Pc7上的PR117M和PR256M之間的區(qū)段上(表1，表2)，這些結(jié)果顯示出連鎖群H2_Pc7在木材密度遺傳控制上具有特殊重要性。

ESTP標記在木材密度的遺傳控制上也發(fā)揮了作用，其中H2_Pc7上的PAL1基因(位點PAL1520)，對全木芯木材基本密度(BD)的效應達到0.05以上的顯著性水平，解釋了該性狀表型方差的14.0%(表1)。

表2 分子標記與年輪木材基本密度(RD)QTL的連鎖

晚材密度的QTL分布有別于年輪木材密度和早材密度，主要分布在H3_Pc5和H4_Pc6(表4)，其中H4_Pc6在年輪密度和早材密度某些性狀上也起比較重要的作用，而在年輪密度和早材密度的遺傳控制中起重要作用的連鎖群，如H2_Pc7和H14_Pc21上面的標記，在這里或者不出現(xiàn)，或者效應較小(表3，表4)。

晚材密度的QTL效應也低于年輪和早材密度，解釋表型方差的比例超過10%的位點較少?？赡苁且驗橥聿拿芏仁苓z傳控制的程度低于年輪木材密度和早材密度，這有待進一步的檢驗。

表3 分子標記與早材基本密度(EWD)QTL的連鎖

表4 分子標記與晚材基本密度(LWD)QTL的連鎖

3 討論與結(jié)論

傳統(tǒng)的數(shù)量遺傳學多以Nilsson[24]的微效多基因假說為基礎。Nilsson假說提出數(shù)量性狀是由數(shù)以百計的基因控制，且各基因的效應微小而且相等。至今幾乎所有在作物和林木上進行的QTL定位研究，均揭示了寡基因模型，即控制數(shù)量性狀的基因間效應是不等的，且常常存在著少數(shù)主效基因，解釋了大部分的表型變異[25]。重要經(jīng)濟性狀的遺傳控制中普遍存在著主效基因[26]。田寶華[27]通過對不同環(huán)境下的玉米穗部進行QTL定位，發(fā)掘與玉米產(chǎn)量性狀密切相關(guān)的穗行數(shù)主效QTL位點；沈新蓮[28]利用1個棉屬野生種異常棉(Ganomalum )基因漸滲的優(yōu)質(zhì)纖維種質(zhì)系，獲得高強纖維的主效QTL。本研究建立的雜種松木材密度的QTL連鎖群，也存在寡基因模型和主效基因現(xiàn)象，這類基因可單獨解釋10%～20%的表型方差?？刂颇静拿芏鹊腝TL位點相對集中分布在4個連鎖群：H2_Pc7,H2_Pc10,H4_Pc6和H14_Pc21，其中H4_Pc6和H14_Pc21兩個連鎖群在木材密度的遺傳控制上起著重要的作用，并且在相對狹窄的范圍內(nèi)連鎖或重疊，呈一因多效模式。

采用SSR和ESTP標記，檢測效率較高。檢測效率的差異與標記類型有關(guān)，也與分析軟件有關(guān)。AFLP為顯性標記，只有3種位點分離信息(PI,MI和BI)[29]，采用Map Manager QTX v0.24和QTL Cartographer v1.14作圖軟件，比較適合于近交物種，它們只能按測交模式進行QTL檢測；SSR和ESTP標記為共分離標記，位點分離信息共有4種(PI,MI,BI和FI)[29]，不少位點上存在復等位基因，Map QTL v4.0能夠按異交模式檢測QTL，對包含復等位基因的位點的檢測效率較高，并在一定程度上彌補了群體較小的缺陷。

在小群體內(nèi)沒有檢測到顯著性水平較高的QTL，原因可能有3個，其一，群體規(guī)模偏??；其二，本研究構(gòu)建的圖譜未能覆蓋全基因組，控制木材密度性狀的部分QTL位于本圖譜以外的區(qū)段；其三，控制木材密度的QTL位點在該群體內(nèi)沒有發(fā)生分離。另外，年度間、季節(jié)間的差異也會影響，如晚材密度(LWD)上的QTL從數(shù)量和效應上都不如早材密(EWD)，這可能是受到年度和季節(jié)氣候差異的影響。Sewell等[30]就木材物理性狀QTL表現(xiàn)受季節(jié)性氣候的影響做過研究，認為氣候因素可能導致與木材形成有關(guān)的細胞產(chǎn)生生物化學變化。比如，在早材和晚材形成過程中植物生長素水平的變化。此外，本研究的研究范圍仍較窄，只對單一密度性狀作出研究，下一步將結(jié)合生長、形質(zhì)性狀的QTL位點進行比較分析。

本研究通過對雜種松木材密度的QTL定位，獲得了控制木材密度的高效QTL連鎖群及主效基因，為進一步對生長、形質(zhì)等性狀進行QTL定位和發(fā)掘更多在各個性狀間共同作用的QTL位點奠定基礎。了解木材相關(guān)性狀的遺傳模式，有助于開展分子遺傳學研究，并為分子標記輔助選擇提供參考，以期最終實現(xiàn)培育出材性優(yōu)良的濕加松雜種的目的，在提高木材商業(yè)價值及木材生產(chǎn)加工品質(zhì)方面具有重要作用。

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