陳澄亮 陳積賢 薛迪新 吳偉力 戴華衛(wèi) 金凱 徐定銀 曹高健 黃振豐 周瑞耀 吳道義 曾鈺

結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多方面、多環(huán)節(jié)綜合調(diào)控的過(guò)程，與飲食、體力活動(dòng)、遺傳易感性等有一定的關(guān)系。結(jié)直腸黏膜細(xì)胞從正常向癌演變、從腺瘤發(fā)展為腺癌的過(guò)程中發(fā)生了一系列基因的改變，但目前關(guān)于這一系列變化的原因尚未明確。微小RNA（miRNA）是一類(lèi)長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，普遍存在于動(dòng)植物和病毒中。miRNA已被發(fā)現(xiàn)在許多腫瘤中表達(dá)異常[1－2]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)探討 miR－30c－1－3p在人結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義，為結(jié)直腸癌在分子水平的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本來(lái)自2014年6月至2015年6月在本院行手術(shù)治療的52例結(jié)直腸癌患者，病理診斷均為腺癌，所有患者術(shù)前均未行放化療；其中男30例，女 22 例；年齡 38～86（64.0±14.8）歲；結(jié)直腸癌的分期依據(jù)2015年美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）公布的結(jié)直腸癌TNM分期法。采集每例患者經(jīng)手術(shù)切除的癌組織及距離癌組織＞5cm的癌旁正常黏膜組織各1份，液氮速凍后放置－80℃恒溫冰箱中保存，留待提取miR－30c－1－3p。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)，采集標(biāo)本前與所有患者簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取 采用Trizol法，Total RNA Exteractor（生工生物工程有限公司）提取總RNA，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。提取完成的總RNA通過(guò)電泳檢驗(yàn)，在紫外透射光下觀察拍照。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 利用提取的總RNA，miR－30c－1－3p加特異性引物，用焦碳酸二乙酯（DEPC）處理后的水定容至 13μl，70°C 溫水浴 5min，置于冰上冰浴 10s，離心，加入4.0μl反應(yīng)緩沖液、2.0μl dNTP、1.0μl RNA 酶抑制劑、2.0μl逆轉(zhuǎn)錄酶（濃度為 10U/μl），37°C 溫水浴5min，42°C 溫水浴 60min，70°C 溫水浴 10min；反應(yīng)完成。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR 體系：SG Fast qPCR Master Mix（High Rox）（2X）（生工生物工程有限公司）10μl，正向引物、反向引物各 0.4μl，cDNA 模板 20μl，DEPC 處理后的水7.2μl；各基因的引物序列見(jiàn)表1。循環(huán)條件：初始維持 95℃ 3min；熔解 95℃ 7s，退火 57℃ 10s，延伸 72℃15s，共循環(huán) 40 次。miR－30c－1－3p 使用 U6 作為內(nèi)參，計(jì)算機(jī)分析Ct值，采用2－ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，即miR－30c－1－3p 表達(dá)水平。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料不符合正態(tài)分布，故用 M（P25，P75）表示，組間比較采用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織與癌旁正常黏膜組織中miR－30c－1－3p表達(dá)水平的比較 結(jié)直腸癌組織中miR－30c－1－3p表達(dá)水平為0.627（0.442，0.935），明顯低于癌旁正常黏膜組織的 0.986（0.694，1.328），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。根據(jù)擴(kuò)增曲線(xiàn)（圖 1），估計(jì) miR－30c－1－3p擴(kuò)增效率基本一致。根據(jù)熔解曲線(xiàn)（圖2），基本判斷miR－30c－1－3p產(chǎn)物單一，不含引物二聚體等其他非目的性產(chǎn)物，熔解溫度為82.08℃。

圖1 miR-30c-1-3p擴(kuò)增曲線(xiàn)

圖2 miR-30c-1-3p熔解曲線(xiàn)

2.2 結(jié)直腸癌組織中miR－30c－1－3p表達(dá)水平與患者臨床特征的關(guān)系 結(jié)直腸癌組織中miR－30c－1－3p表達(dá)水平與患者有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)（均P＜0.05），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期的患者結(jié)直腸癌組織中miR－30c－1－3p表達(dá)水平均較低；與患者性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤位置、分化程度、浸潤(rùn)深度等均無(wú)關(guān)（均 P＞0.05），見(jiàn)表2。

3 討論

在結(jié)直腸腫瘤中，有些基因被認(rèn)為是導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展的癌基因如K－ras基因，有些被認(rèn)為是抑癌基因如APC基因；此外，錯(cuò)配修復(fù)基因的突變、基因過(guò)度表達(dá)等在腫瘤進(jìn)展中也起到重要作用。miRNA是近年來(lái)作為抑癌基因或原癌基因被報(bào)道較多的小分子基因，已發(fā)現(xiàn)其在許多腫瘤組織中表達(dá)異常，且參與腫瘤的生長(zhǎng)[3]、增殖[4]、侵襲[5]、轉(zhuǎn)移[6]、凋亡等，被認(rèn)為是治療腫瘤的新靶點(diǎn)[7-8]。

miR-30c是miRNA家族的成員之一。近年來(lái)研究表明miR-30c-1-3p通過(guò)3′非編碼區(qū)改變靶基因細(xì)胞色素p450 3A4，從而使受體不表達(dá)[9]。相關(guān)研究報(bào)道m(xù)iR-30c在乳腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤組織中表達(dá)升高[10-11]，Huang等[12]研究發(fā)現(xiàn)miR-30c通過(guò)靶基因ASF/SF2腫瘤蛋白剪接因子來(lái)抑制前列腺癌細(xì)胞的存活。Agostini等[13]研究認(rèn)為miR-30c在卵巢腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)。Cao等[14]研究發(fā)現(xiàn)miR-30c-5p通過(guò)靶點(diǎn)MTA1來(lái)抑制胃癌的遷移以及上皮細(xì)胞到間葉細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn)miR-30a-5p通過(guò)調(diào)節(jié)GRP78表達(dá)，從而抑制腎細(xì)胞癌的生長(zhǎng)。Kawaguchi等[16]認(rèn)為乳腺癌患者生存率的提高與miR-30a的高表達(dá)有關(guān)。除了腫瘤學(xué)領(lǐng)域，miR-30c還被發(fā)現(xiàn)能減少高血脂和2型糖尿病小鼠的血漿TC水平[17]。Singh等[18]研究表明恢復(fù)miR-30a的表達(dá)，能抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤的致瘤性，且有自噬抑制作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-30c-1-3p在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯下調(diào)，與患者有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等有關(guān)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤位置、分化程度、浸潤(rùn)深度等無(wú)關(guān)；這提示miR-30c-1-3p可能與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)。因此，筆者提出大膽假設(shè)：在結(jié)直腸癌的發(fā)生過(guò)程中，miR-30c-1-3p表達(dá)水平會(huì)降低；若能通過(guò)方法將miR-30c-1-3p的表達(dá)上調(diào)，有望抑制結(jié)直腸癌的進(jìn)展。

綜上所述，miR-30c-1-3p在人結(jié)直腸癌組織中表達(dá)下調(diào)，與有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)；提示miR-30c-1-3p可能與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)。

表2 結(jié)直腸癌組織中miR-30c-1-3p表達(dá)水平與患者臨床特征的關(guān)系

[1]Chruscik A,Lam AK.Clinicalpathologicalimpacts of micrornas in papillary thyroid carcinoma:A crucial review[J].Experimental and molecular pathology,2015,99(3):393-398.

[2]Hollis M,Nair K,Vyas A,et al.Micrornas potential utility in colon cancer:Early detection,prognosis,and chemosensitivity[J].World journalof gastroenterology,2015,21(27):8284-8292.

[3]Xu Y,Chen J,Gao C,et al.Microrna-497 inhibits tumor growth through targeting insulin receptor substrate 1 in colorectal cancer[J].Oncology letters,2017,14(6):6379-6386.

[4]Li D,Wang H,Song H,et al.The micrornas mir-200b-3p and mir-429-5p target the limk1/cfl1 pathway to inhibit growth and motility of breast cancer cells[J].Oncotarget,2017,8(49):85276-85289.

[5]Boguslawska J,Rodzik K,Poplawski P,et al.Tgf-beta1 targets a microrna network that regulates cellular adhesion and migration in renalcancer[J].Cancer letters,2018,412:155-169.

[6]Mjelle R,Sellaeg K,Saetrom P,et al.Identification of metastasis-associated micrornas in serum from rectal cancer patients[J].Oncotarget,2017,8(52):90077-90089.

[7]Bahrami A,Aledavood A,Anvari K,et al.The prognostic and therapeutic application of micrornas in breast cancer:Tissue and circulating micrornas[J].Journal of cellular physiology,2018,233(2):774-786.

[8]Moridikia A,Mirzaei H,Sahebkar A,et al.Micrornas:Potential candidates for diagnosis and treatment of colorectal cancer[J].Journalof cellular physiology,2018,233(2):901-913.

[9]Vachirayonstien T,Yan B.Microrna-30c-1-3p is a silencer of the pregnane x receptor by targeting the 3'-untranslated region and alters the expression of its target gene cytochrome p450 3a4[J].Biochimica et biophysica acta,2016,1859(9):1238-1244.

[10]Yen MC,Shih YC,Hsu YL,et al.Isolinderalactone enhances the inhibition of socs3 on stat3 activity by decreasing mir-30c in breast cancer[J].Oncology reports,2016,35(3):1356-1364.

[11]Ling XH,Chen ZY,Luo HW,et al.Bcl9,a coactivator for wnt/beta-catenin transcription,is targeted by mir-30c and is associ-ated with prostate cancer progression[J].Oncology letters,2016,11(3):2001-2008.

[12]Huang YQ,Ling XH,Yuan RQ,et al.Mir30c suppresses prostate cancer survivalby targeting the asf/sf2 splicing factor oncoprotein[J].Molecular medicine reports,2017,16(3):2431-2438.

[13]Agostini A,Brunetti M,Davidson B,et al.Genomic imbalances are involved in mir-30c and let-7a deregulation in ovarian tumors:Implications for hmga2 expression[J].Oncotarget,2017,8(13):21554-21560.

[14]Cao JM,LiGZ,Han M,et al.Mir-30c-5p suppresses migration,invasion and epithelial to mesenchymal transition of gastric cancer via targeting mtal[J].Biomedicine&pharmacotherapy,2017,93:554-560.

[15]Wang C,Cai L,Liu J,et al.Microrna-30a-5p inhibits the growth of renal cell carcinoma by modulating grp78 expression[J].Cellular Physiology&Biochemistry International Journal of Experimental Cellular Physiology Biochemistry&Pharmacology,2017,43(6):2405.

[16]Kawaguchi T,Yan L,Qi Q,et al.Overexpression of suppressive micrornas,mir-30a and mir-200c are associated with improved survival of breast cancer patients[J].Scientific reports,2017,7(1):15945.

[17]Irani S,Iqbal J,Antoni WJ,et al.Microrna-30c reduces plasma cholesterol in homozygous familial hypercholesterolemic and type 2 diabetic mouse models[J].Journaloflipid research,2017.pii:jlr.M081299.doi:10.1194/jlr.M081299.[Epub ahead of print]

[18]Singh SV,Dakhole AN,Deogharkar A,et al.Restoration of mir-30a expression inhibits growth,tumorigenicity of medulloblastoma cells accompanied by autophagy inhibition[J].Biochemical and biophysical research communications,2017,491(4):946-952.