王丹丹 陳剛 葉俏 鮑軼 官俏兵

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨退變?yōu)橹饕卣鞯年P(guān)節(jié)疾病，它是導(dǎo)致老年人慢性肌肉骨骼疼痛和活動(dòng)障礙的最主要原因，但是目前關(guān)于OA的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。微小RNA（miRNA）是一類小分子非編碼RNA，具有保持和調(diào)節(jié)人體正常生理功能的重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)miRNA異常表達(dá)與OA的發(fā)生密切相關(guān)[1]，但關(guān)于miR-34b在OA中的生理功能和潛在的分子機(jī)制尚不明確。故本研究檢測miR-34b在OA軟骨細(xì)胞中的表達(dá)，通過轉(zhuǎn)染miR-34b的模擬物或抑制物調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞內(nèi)miR-34b的表達(dá)量，探索其對(duì)軟骨細(xì)胞基質(zhì)代謝和Smad3表達(dá)的影響；同時(shí)檢測miR-34b是否直接靶向Smad3，進(jìn)而初步解釋miR-34b在OA發(fā)病機(jī)制中的作用，為OA的預(yù)防與治療提供新的切入點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來源 標(biāo)本來自2014年6月至2015年10月本院骨科收治的住院患者。OA軟骨組織標(biāo)本取自10例行全膝關(guān)節(jié)置換的OA患者（依據(jù)美國風(fēng)濕病協(xié)會(huì)OA診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷為膝關(guān)節(jié)終末期OA[2]）的膝關(guān)節(jié)，排除有糖尿病、骨骼發(fā)育障礙性疾病、其他類型關(guān)節(jié)炎、腫瘤、感染、其他慢性炎癥性疾病以及糖皮質(zhì)激素治療史者。正常膝關(guān)節(jié)軟骨組織標(biāo)本取自7例因車禍而截肢患者的膝關(guān)節(jié)，排除有糖尿病、關(guān)節(jié)痛、關(guān)節(jié)功能受限、其他類型關(guān)節(jié)炎罹患史、惡性腫瘤以及糖皮質(zhì)激素治療史者。本實(shí)驗(yàn)使用的人軟骨組織標(biāo)本符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)原則，標(biāo)本采集取得所有患者的知情同意。

1.2 儀器及試劑 人軟骨肉瘤細(xì)胞株SW1353購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；DMEM/F12培養(yǎng)基、FBS、青霉素、鏈霉素均購自美國Gibco公司；胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶均購自美國sigma公司；Lipofectamine 2000、Trizol試劑均購自美國Invitrogen公司；實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) （RT-qPCR）試劑盒購自日本Toyobo公司；2×Taq PCR Master Mix購自美國Applied Biosystems公司；經(jīng)過特殊化學(xué)修飾的miR-34b模擬物（miR-34b mimic）、miR-34b抑制物（miR-34b inhibitor）、無義序列均購自廣州銳博生物公司；PCR儀購自美國Biometra公司；恒溫CO2培養(yǎng)箱購自德國Heraeus公司。

1.3 軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將收集的OA軟骨組織和正常膝關(guān)節(jié)軟骨組織置于無菌培養(yǎng)皿，0.25%的胰蛋白酶37℃消化30min，PBS清洗；剪碎軟骨組織至1mm×1mm×1mm大小，加0.2%的Ⅱ型膠原酶，置搖床上37℃消化5h；過濾器過濾，收集濾液，離心收集細(xì)胞；將細(xì)胞懸浮于含10%FBS、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中。SW1353細(xì)胞用含有10%FBS、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2d更換1次培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染時(shí)SW1353細(xì)胞接種在6孔板內(nèi)，待80%細(xì)胞匯合后用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染，參照說明書進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)設(shè)4組：空白對(duì)照組（只加入等量的脂質(zhì)體，A組）、SW1353細(xì)胞轉(zhuǎn)染無義序列組（B組）、SW1353細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-34b mimic組（C組）、SW1353細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-34b inhibitor組（D組）。

1.4 RT-qPCR 引物設(shè)計(jì)及合成委托英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行，各基因的引物序列見表1。以Trizol試劑、氯仿提取軟骨細(xì)胞的總RNA，異丙醇沉淀回收RNA，75%乙醇洗滌RNA沉淀。取≤1μg的RNA，以各基因引物片段為特異引物，用ReverTra Ace-α-試劑盒合成cDNA。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5min；然后進(jìn)入94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min的循環(huán)（共40次）。以β-actin和 U6分別作為mRNA和miRNA的內(nèi)參，計(jì)算機(jī)分析Ct值，采用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，即miR-34b表達(dá)水平。

表1 RT-qPCR反應(yīng)引物序列

1.5 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 使用Targetscan基因信息軟件預(yù)測得到Smad3是miR-34b靶基因，構(gòu)建Smad3 野生型及突變型 3′非編碼區(qū)（3′-UTR）-熒光素酶報(bào)告載體，利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測miR-34b對(duì)Smad3基因野生型及突變型3′-UTR熒光素酶活性的影響。293T細(xì)胞使用DMEM/F12培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；將熒光素酶報(bào)告載體與miR-34b mimic及對(duì)照組無義序列共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，36h后收獲細(xì)胞；使用熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OA軟骨組織與正常膝關(guān)節(jié)軟骨組織中miR－34b表達(dá)水平比較 OA軟骨組織中miR－34b表達(dá)水平（2.79±1.94）明顯高于正常膝關(guān)節(jié)軟骨組織（0.11±0.17），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 SW1353細(xì)胞轉(zhuǎn)染后miR－34b表達(dá)水平 SW1353細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，與A組miR－34b表達(dá)水平（0.12±0.19）比較，C 組（3.79±0.11）明顯升高，D 組（0.01±0.03）明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；A組與B組（0.11±0.18）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。

2.3 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果 經(jīng)生物信息學(xué)軟件預(yù)測，Smad3是miR－34b的潛在靶基因。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，共轉(zhuǎn)染miR－34b mimic與pMiR－ReportTM－Smad3野生型3′－UTR質(zhì)粒后，熒光強(qiáng)度較轉(zhuǎn)染無義序列、pMiR－ReportTM－Smad3 野生型 3′－UTR質(zhì)粒均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；共轉(zhuǎn)染 miR－34b mimic與pMiR－ReportTM－Smad3突變型3′－UTR質(zhì)粒后，熒光強(qiáng)度與轉(zhuǎn)染無義序列、pMiRReportTM－Smad3 突變型 3′－UTR 質(zhì)粒比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；提示miR－34b可特異性地與Smad3的3′－UTR結(jié)合。RT－qPCR法進(jìn)一步檢測轉(zhuǎn)染miR－34b mimic和 miR－34 inhibitor后 Smad3基因mRNA 表達(dá)水平，與A 組（0.51±0.12）比較，C組（0.07±0.04）明顯降低，D 組（1.12±0.06）明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05）；A 組與 B 組（0.52±0.08）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 轉(zhuǎn)染后SW1353細(xì)胞中Ⅱ型膠原、MMP－13的mRNA表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染后，與A組比較，C組Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)水平明顯降低，D組明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；C組MMP－13 mRNA明顯升高，D組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表2。

表2 4組不同條件下細(xì)胞的Ⅱ型膠原、MMP-13 mRNA表達(dá)水平比較

3 討論

早期診斷、早期治療OA具有重要的臨床意義。miRNA是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，普遍存在于在動(dòng)物和植物中，在基因表達(dá)方面有重要的調(diào)控作用。miRNA通過與靶mRNA的3′－UTR結(jié)合，進(jìn)而降解靶mRNA或抑制mRNA轉(zhuǎn)錄后翻譯，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的生成，從而發(fā)揮效應(yīng)[3－4]。在生物發(fā)育的不同階段，miRNA對(duì)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過程均有影響，因此它能對(duì)機(jī)體發(fā)育、體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的保持和骨代謝等過程進(jìn)行調(diào)解[5－6]。miRNA異常表達(dá)可能會(huì)引起OA，如Iliopoulos等[7]發(fā)現(xiàn)人OA軟骨細(xì)胞內(nèi)miR－140表達(dá)水平明顯下降，Miyaki等[8]通過構(gòu)建miR－140基因缺失小鼠，成功誘導(dǎo)出以蛋白多糖丟失、關(guān)節(jié)軟骨纖維化為特征的OA樣改變。因此，確定OA中miRNA發(fā)揮作用的分子機(jī)制非常重要。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，OA軟骨細(xì)胞中miR－34b表達(dá)水平較正常軟骨細(xì)胞明顯增加。

miRNA需要通過與其靶基因相互作用，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)基因表達(dá)的功能。因此，首先要尋找miR－34b靶基因。筆者使用Targetscan基因信息軟件預(yù)測，發(fā)現(xiàn)Smad3 mRNA的3′UTR中含有與miR－34b互補(bǔ)結(jié)合的序列。進(jìn)一步作熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，證實(shí)Smad3是miR－34b的直接靶基因，且在SW1353細(xì)胞中過表達(dá)miR－34b后，Smad3 mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)。以上結(jié)果表明Smad3是miR－34b的功能介導(dǎo)者。轉(zhuǎn)化生長因子－β（TGF－β）信號(hào)通路在軟骨細(xì)胞的分化、增殖和成熟以及軟骨基質(zhì)的合成中具有重要的調(diào)節(jié)作用，TGF－β信號(hào)通路異常與OA的發(fā)生密切相關(guān)[9]。Smad3是連接細(xì)胞外TGF－β信號(hào)的細(xì)胞內(nèi)分子，在缺乏Smad3的小鼠中可觀察到OA癥狀[10]。另外，過表達(dá)的Smad3會(huì)提高軟骨形成過程中軟骨細(xì)胞的生長和分化，下調(diào)Smad3會(huì)減弱這個(gè)過程[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR－34b可能通過抑制Smad3的活性，從而影響TGF－β信號(hào)通路，促進(jìn)軟骨細(xì)胞分解代謝，加速軟骨基質(zhì)降解，最后導(dǎo)致OA。

本研究進(jìn)一步驗(yàn)證miR－34b在OA發(fā)病機(jī)制中的作用，即轉(zhuǎn)染miR－34b mimic或inhibitor上調(diào)或抑制SW1353細(xì)胞中miR－34b的表達(dá)后，利用RT－qPCR檢測Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR－34b mimic轉(zhuǎn)染后，Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)下調(diào)，而miR－34b inhibitor會(huì)上調(diào)Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)。以上結(jié)果提示miR－34b可以抑制軟骨細(xì)胞的合成代謝能力。MMP－13在OA的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用[12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR－34b mimic時(shí)，MMP－13 mRNA表達(dá)水平明顯升高；轉(zhuǎn)染miR－34b inhibitor時(shí)，MMP-13 mRNA表達(dá)水平明顯下降。前期相關(guān)研究報(bào)道在人和鼠軟骨細(xì)胞中，降低Smad3表達(dá)水平會(huì)導(dǎo)致MMP-13表達(dá)水平升高[13]。以上結(jié)果表明，miR-34b可能通過靶向抑制Smad3的表達(dá)，從而促進(jìn)軟骨細(xì)胞基質(zhì)的分解代謝。

綜上所述，miR-34b在OA軟骨細(xì)胞中表達(dá)明顯上調(diào)；miR-34b可能通過靶向調(diào)節(jié)Smad3的表達(dá)，誘導(dǎo)人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞基質(zhì)退變，進(jìn)而促進(jìn)OA的發(fā)展。關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中miR-34b的功能研究可為OA的預(yù)防與治療提供新的切入點(diǎn)，建議多關(guān)注其影響軟骨基質(zhì)代謝的分子機(jī)制研究，這可能為OA的防治開拓新的領(lǐng)域。

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