楊齊華 葉國良 徐拔群 洪曉波

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的惡性腫瘤。最新統(tǒng)計顯示全球有超過140萬例CRC患者，每年約有69.39萬例死亡，占所有癌癥死亡人數(shù)的8%[1]，居癌癥死亡率的第4位[2]。生活環(huán)境、飲食習(xí)慣、遺傳和表觀遺傳調(diào)控間的多步驟、多基因的復(fù)雜過程參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[3]。其中表觀遺傳調(diào)控的一個主要機制是DNA甲基化，主要是啟動子區(qū)域CpG島的甲基化，同時在啟動子區(qū)外也有內(nèi)含子及外顯子區(qū)域CpG島的甲基化，還有非CpG島的甲基化[4－5]。DNA甲基化在細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、胚胎發(fā)育、遺傳印記及人類腫瘤的發(fā)生中具有重要作用[6－7]，是當(dāng)前研究的熱點。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)在CRC中，不同病理分型患者的部分甲基化基因差異較為明顯[8]。另有研究發(fā)現(xiàn)，與其基因本身的調(diào)控比較，DNA甲基化可能對基因表達(dá)的調(diào)控更有優(yōu)勢[9－18]。人Wnt基因定位于12q13，在胚胎發(fā)育中，Wnt通路是Wnt基因調(diào)控的重要信號傳導(dǎo)系統(tǒng)[19]。在CRC研究中，Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在調(diào)控結(jié)直腸腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等方面具有重要作用，可能成為分子靶向抗結(jié)直腸腫瘤藥物[20－22]?；诋?dāng)前主要芯片平臺的研究和目前CRC診斷手段的優(yōu)缺點，本研究主要探討Wnt6、Wnt3A、LEF1和FZD1基因在CRC組織及正常結(jié)直腸組織中的甲基化狀態(tài)，同時探討以上基因啟動子高甲基化后是否會導(dǎo)致基因表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而推斷表觀遺傳是否起了主導(dǎo)作用。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇本院2015年12月至2016年12月收治的CRC患者55例為觀察組，其中男35例，女20例；年齡≤60歲30例，＞60歲25例；腫瘤位置：近端37例，遠(yuǎn)端18例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期21例，Ⅲ～Ⅳ期34例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移5例；所有患者術(shù)中病理檢查確診為CRC，術(shù)前均未接受過放化療或其他聯(lián)合治療。選擇本院同期正常健康體檢者55例為對照組，其中男33例，女22例；年齡≤60歲29例，＞60歲26例。兩組受檢者性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過，所有受檢者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器 β－actin引物（上海生工生物技術(shù)公司合成）、QIAGEN試劑盒（Qiagen公司）、PCR儀（Eppendorf公司）、Trizol試劑盒（上海閃晶分子生物科技有限公司）、DNA提取試劑盒（QIAGEN試劑盒）、離心機（長沙英泰儀器有限公司）、微量紫外分光光度計（上海讓奇儀器科技有限公司）、CT轉(zhuǎn)換試劑盒（上海晶抗生物工程有限公司）、DNA甲基化試劑盒（北京天漠科技開發(fā)有限公司）。

1.2.2 標(biāo)本收集 （1）CRC組織及對照者結(jié)直腸組織標(biāo)本收集（對照者自愿接受腸鏡檢查及組織標(biāo)本采集）：收集組織標(biāo)本后立即放于標(biāo)本管中，同時加入RNA保存液，放于冰塊中，隨后迅速放于－80℃冰箱內(nèi)保存。（2）CRC患者術(shù)前血標(biāo)本及對照者外周血標(biāo)本收集：采集血標(biāo)本3～5ml，放于紫色管中，EDTA抗凝；隨后迅速放于－80℃冰箱內(nèi)保存。（3）CRC患者術(shù)前糞便標(biāo)本及對照者糞便標(biāo)本收集：收集糞便標(biāo)本，分裝后迅速放于－80℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.3 基因組DNA提取 提取結(jié)直腸組織基因組DNA以及血液、糞便中脫落細(xì)胞的DNA。取樣本，溶解，處理。加20μl蛋白酶K，渦旋混勻，簡單離心。加200μl緩沖液裂解液，渦旋15s，70℃水浴10min，簡單離心。加200μl無水乙醇，渦旋混合。轉(zhuǎn)移混合物至離心柱中，該柱子放在2ml收集管中，8 000r/min離心1min。把離心柱放在干凈的2ml收集管中，收取管子，棄濾液。小心打開離心柱，加500μl緩沖液洗滌液1，8 000r/min離心1min。將離心柱放在干凈的2ml收集管中，棄濾液。小心打開離心柱，加500μl緩沖液洗滌液2，25 000r/min離心3min。把離心柱放在新的2ml收集管中，棄濾液。30 000r/min離心1min。把離心柱放在干凈的1.5ml離心管，棄濾液。小心打開離心柱，加200μl蒸餾水，清洗濾柱膜。室溫靜置1min，8 000r/min離心1min。最后使用微量紫外分光光度計測定所提取的基因組DNA濃度，要求＞30ng/μl，A260/A280范圍為 1.8～2.0。測好濃度后置于－20℃冰箱存儲。血液及糞便樣本的操作步驟與組織標(biāo)本類似。隨后進(jìn)行亞硫酸氫鈉修飾及CT轉(zhuǎn)換試劑盒、DNA甲基化試劑盒處理作甲基化轉(zhuǎn)化，置于－20℃冰箱存儲。

1.2.4 甲基化特異性PCR（MSP） 通過在線 Meth－Primer軟件分別設(shè)計針對甲基化和非甲基化序列的引物，并進(jìn)行PCR擴增；然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確定與引物互補的DNA序列的甲基化狀態(tài)。MSP法顯示W(wǎng)nt6、Wnt3A、LEF1和FZD1基因分別大于相應(yīng)的截斷值，即甲基化陽性。分別計算糞便脫落細(xì)胞DNA中Wnt6、Wnt3A、LEF1和FZD1基因啟動子甲基化陽性率（甲基化陽性例數(shù)/每組例數(shù)）和糞便脫落細(xì)胞DNA中相關(guān)基因啟動子甲基化對Ⅰ～Ⅱ期CRC的發(fā)現(xiàn)率（甲基化陽性例數(shù)/Ⅰ～Ⅱ期CRC例數(shù)）。引物信息見表1。

表1 MSP引物信息

1.2.5 RT－PCR 采用Trizol法抽提組織中總RNA。取50～100mg組織置于1.5ml離心管中，加1ml Trizol充分勻漿，室溫靜置5min。加0.2ml氯仿，振蕩15s，靜置2min。4℃、15 000r/min離心15min，取上清液。加0.5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min。4℃、15 000r/min離心10min，棄上清液。加入1ml 75%乙醇，輕輕洗滌沉淀。4℃、8 000r/min離心5min，棄上清液。晾干，加入適量的DEPC H2O溶解（5℃促溶10～15min）。隨后使用nanodrop2000微量紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度，取A260/A280為1.8～2.0的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以兩步法進(jìn)行RT－PCR，然后進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，利用軟件分析電泳條帶灰度值，相對含量=目的基因/內(nèi)參β－actin。

1.2.6 Western－blot 采用Western－blot法提取組織中總蛋白。將少量組織置于1～2ml勻漿器中球狀部位，盡量碾碎。加400μl單去污劑裂解液（含L－苯甲基磺酰氟）在勻漿器中進(jìn)行勻漿，冰置數(shù)分鐘后，再研磨組織，重復(fù)數(shù)次，使組織盡量碾碎。裂解30min后取裂解液，4℃、12 000r/min離心5min。取上清液分裝并存于－20℃冰箱內(nèi)。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測上清液蛋白濃度。提取的組織蛋白進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠（SDSPAGE）電泳，使用12%的分離膠分離 Wnt6、Wnt3A、LEF1和FZD1蛋白，電泳后采用半干式轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，用5%的脫脂牛奶封閉1h（37℃），加Wnt6、Wnt3A、LEF1 和 FZD1 抗體（1∶1 000），37℃孵育1h；HRP 標(biāo)記的兔抗鼠二抗（1∶1 000），37℃孵育 1h；βactin 單克隆抗體（1∶100）作為內(nèi)參照，孵育 3h。使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測雜交信號顯示條帶。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DNA提取結(jié)果及人基因組DNA的確認(rèn) 取A260/A280為1.8～2.0的110例糞便脫落細(xì)胞DNA樣本進(jìn)行PCR反應(yīng)擴增，均可以擴增出人β－actin基因片段，部分?jǐn)U增產(chǎn)物結(jié)果見圖1。

圖1 人基因β基actin擴增片段電泳圖

2.2 兩組受檢者糞便脫落細(xì)胞DNA中相關(guān)基因啟動子甲基化陽性結(jié)果 MSP顯示W(wǎng)nt6、Wnt3A、LEF1和FZD1基因存在甲基化或非甲基化，見圖2。觀察組糞便脫落細(xì)胞DNA中Wnt6、Wnt3A、LEF1和FZD1基因啟動子甲基化陽性率分別為 69.1%（38/55）、63.6%（35/55）、54.5%（30/55）和 56.4%（31/55），4 種基因總甲基化陽性率為90.9%（50/55）；對照組糞便脫落細(xì)胞DNA中Wnt6、Wnt3A、LEF1和FZD1基因啟動子甲基化陽性率分別為 0.0%、1.8%（1/55）、0.0%和 1.8%（1/55），4 種基因總甲基化陽性率為3.6%（2/55）。

圖2 糞便脫落細(xì)胞DNA中Wnt6、Wnt3A、LEF1和FZD1基因啟動子甲基化的電泳圖（P1-P7為平行PCR；U為非甲基化；M為甲基化，dH2O為單蒸水）

2.3 糞便脫落細(xì)胞DNA中相關(guān)基因啟動子甲基化對Ⅰ～Ⅱ期CRC的發(fā)現(xiàn)率 糞便脫落細(xì)胞DNA中Wnt6、Wnt3A、LEF1和FZD1基因啟動子甲基化對Ⅰ～Ⅱ期CRC 的發(fā)現(xiàn)率分別為 80.9%（17/21）、71.4%（15/21）、57.1%（12/21）和 57.1%（12/21），聯(lián)合檢測 4 種基因啟動子甲基化對Ⅰ～Ⅱ期CRC的發(fā)現(xiàn)率為90.5%（19/21）。

2.4 CRC患者糞便脫落細(xì)胞DNA中相關(guān)基因啟動子甲基化與臨床病理特征的關(guān)系 CRC患者糞便脫落細(xì)胞DNA中Wnt6、Wnt3A、LEF1和FZD1基因啟動子甲基化與患者性別、年齡、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤部位、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均未見相關(guān)（均P＞0.05），見表2。

表2 55例CRC患者糞便脫落細(xì)胞DNA中相關(guān)基因啟動子甲基化與臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

2.5 不同標(biāo)本類型相關(guān)基因啟動子甲基化陽性率比較觀察組與對照組結(jié)直腸組織、血標(biāo)本、糞便標(biāo)本中Wnt6、Wnt3A、LEF1和FZD1基因啟動子甲基化陽性率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見表3。

表3 不同標(biāo)本類型相關(guān)基因啟動子甲基化陽性率[例（%）]

2.6 兩組受檢者結(jié)直腸組織中相關(guān)基因啟動子甲基化后mRNA水平比較 兩組受檢者結(jié)直腸組織中Wnt6、Wnt3A、LEF1和FZD1基因啟動子甲基化后mRNA水平均有所下調(diào)，觀察組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.01），見圖 3。

圖 3 兩組受檢者結(jié)腸組織中相關(guān)基因啟動子甲基化后 mRNA 水平比較（a：WNT6；b：WNT3A；c：LEF1；d：FZD1；*與對照組比較，P＜0.05）

2.7 兩組受檢者結(jié)直腸組織中相關(guān)基因啟動子甲基化后蛋白表達(dá)水平比較 兩組受檢者結(jié)直腸組織中Wnt6、Wnt3A、LEF1和FZD1基因啟動子甲基化后蛋白水平均有不同程度的下調(diào)，觀察組與對照組的電泳圖差異明顯，見圖4。

圖4 兩組受檢者結(jié)直腸組織中相關(guān)基因啟動子甲基化后蛋白表達(dá)的電泳圖

3 討論

表觀遺傳調(diào)控的一個主要機制是DNA甲基化。大多數(shù)脊椎動物基因組DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，DNA的CG兩個核苷酸的胞嘧啶在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下被選擇性地甲基化，形成5-甲基胞嘧啶。這常見于基因的5′-CG-3′序列，DNA甲基化的主要位點是CpG位點，常在基因上游調(diào)控區(qū)的啟動子區(qū)域高度聚集，以CpG島的形式存在。被甲基化的基因位點可隨DNA的復(fù)制而復(fù)制，從而遺傳下去。DNA甲基化能改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA穩(wěn)定性、DNA構(gòu)象以及DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方式，從而起到調(diào)控基因表達(dá)的作用。甲基化模式包括特異基因的高甲基化或低甲基化，與異?；蜣D(zhuǎn)錄相關(guān)[14-15]，DNA甲基化通常針對轉(zhuǎn)座因子或改變沉默相鄰基因的轉(zhuǎn)錄（DNA甲基化直接干擾特異轉(zhuǎn)錄因子與各自啟動子的識別區(qū)結(jié)合）。如AP-2、CAREB、E2F轉(zhuǎn)錄因子能識別含CpG殘基的序列，當(dāng)CpG殘基上的C被甲基化后，結(jié)合作用即被抑制；序列特異性的甲基化DNA結(jié)合蛋白與啟動子區(qū)甲基化CpG島結(jié)合，募集組蛋白去乙?；福℉DAC），形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，阻止轉(zhuǎn)錄因子與啟動子區(qū)靶序列的結(jié)合，從而影響基因的轉(zhuǎn)錄[16-18]。因此，與其基因本身的調(diào)控比較，DNA甲基化可能對基因表達(dá)的調(diào)控具有明顯優(yōu)勢。

目前臨床上診斷CRC的方法很多。（1）螺旋CT對CRC的診斷被廣泛使用，但它對晚期疾病的靈敏度、特異度較好，早期診斷的準(zhǔn)確性較差，且為有創(chuàng)檢查；（2）腫瘤標(biāo)志物如CA19－9、CA153等為無創(chuàng)手段，但在診斷CRC的陽性率較低，準(zhǔn)確性較差；（3）內(nèi)鏡檢查目前主要用于CRC的早期診斷，是一種有創(chuàng)檢查，部分患者可能會拒絕此項檢查[23-25]。目前相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化可能成為診斷癌癥的新分子標(biāo)志物，特別在無創(chuàng)、快捷取得血液、尿液、痰等標(biāo)本以及診斷價值高等方面具有優(yōu)勢，在提前發(fā)現(xiàn)癌癥方面具有很大潛力[26-28]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血液及糞便脫落細(xì)胞中DNA均有高甲基化，可見血液或糞便基因啟動子甲基化的檢測有望成為CRC無創(chuàng)診斷或高風(fēng)險人群篩查的一個新工具。

甲基化檢測根據(jù)研究位點不同，可分為2種，即基因組整體水平的甲基化檢測和特異位點甲基化的檢測。其中基因組整體水平的甲基化檢測方法主要有免疫化學(xué)法、高效液相色譜柱（HPLC）法、CpG甲基轉(zhuǎn)移酶法等；而特異位點甲基化的檢測方法包括直接測序法、MSP 法、Pyrosequencing（PSQ）測序、熒光法等，這些方法都是基于亞硫酸氫鹽處理的基因啟動子甲基化檢測方法。其中MSP法是一種快速檢測方法，它的優(yōu)點歸納如下：（1）不涉及使用限制性內(nèi)切酶，不會出現(xiàn)因使用內(nèi)切酶而引發(fā)的相關(guān)實驗問題；（2）靈敏度高，可檢出比例為1∶1 000的甲基化等位基因片段，不需要要求太高的DNA質(zhì)量即可達(dá)到基因高甲基化檢出率；（3）對DNA標(biāo)本來源的要求不高，石蠟包埋組織DNA或少量DNA即可進(jìn)行甲基化分析；（4）實驗操作簡便，費用低。本研究采用MSP法檢測 Wnt6、Wnt3A、LEF1和 FZD1基因啟動子甲基化情況，結(jié)果顯示觀察組與對照組結(jié)直腸組織、血標(biāo)本、糞便標(biāo)本中Wnt6、Wnt3A、LEF1和FZD1基因啟動子甲基化陽性率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；聯(lián)合檢測糞便標(biāo)本中4種基因啟動子甲基化對Ⅰ～Ⅱ期CRC的發(fā)現(xiàn)率為90.5%。以上結(jié)果提示MSP法檢測糞便脫落細(xì)胞DNA中Wnt6、Wnt3A、LEF1和FZD1基因啟動子甲基化是一種CRC早期篩查的有效方法。

綜上所述，MSP法檢測結(jié)直腸組織、血液及糞便脫落細(xì)胞DNA中Wnt6、Wnt3A、LEF1和FZD1基因啟動子甲基化是一種CRC早期篩查的有效方法。

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