董承帆，唐麗杰

（東北農(nóng)業(yè)大學，黑龍江 哈爾濱 150030）

藍舌病(Bluetongue，BT)由藍舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)引起的家養(yǎng)或野生反芻動物的一種典型的非接觸性病毒性傳染病。目前，這一疾病是 OIE劃定的 A類疫病之一，我國已將其規(guī)定為一類動物傳染病。該病自1905年被科學家Theiler確認以后，在世界各地均有發(fā)生，感染動物的死亡率高，疾病若不能被盡早發(fā)現(xiàn)將很難得到有效控制，因此，選擇并建立有效的檢測方法是控制本病的關(guān)鍵。

1 藍舌病的流行特點

BTV是一種嚴重危害反芻動物的一類動物烈性傳染病。BTV感染綿羊，主要危害羔羊。感染羊主要表現(xiàn)為發(fā)熱、精神不振、食欲廢絕，隨著病程的進一步發(fā)展可見，口鼻部典型的“藍舌”病變。BTV可經(jīng)胎盤感染胎兒，引起流產(chǎn)、死胎或胎兒先天性異常，嚴重時可使整個羊群喪失一個產(chǎn)羔期的全部羔羊。BT主要通過媒介昆蟲傳播，因此當媒介昆蟲盛行的季節(jié)，極易引起本病的發(fā)生。庫蠓作為主要的傳播媒介在傳播疾病的過程中扮演著重要的角色。感染未發(fā)病的反芻動物，如牛、鹿等成為陰性攜帶者。

BTV在世界范圍內(nèi)分布和流行，已有流行的BTV可分為 26個血清型，且型與型之間無交叉保護作用。BTV因血清型的原因，需要針對特定血清型制定相應(yīng)的解決辦法。近年來，在瑞士和科威特的山羊和綿羊體內(nèi)又分離到兩個新的血清型BTV，分別為BTV-25和BTV-26。新的血清型的出現(xiàn)會使未免疫的易感動物感染而發(fā)病，甚至死亡，造成嚴重的經(jīng)濟損失，因此使用適宜的診斷方法對BTV進行檢測至關(guān)重要。

2 藍舌病的診斷方法

2.1 病原學檢查

（1）病料采集 宜采全血(加2U肝素/mL)、動物病毒血癥期的肝、脾、腎、淋巴結(jié)、精液(置冷藏容器保存，24h內(nèi)送到實驗檢查處理)。

（2）直接鏡檢 取病羊的脾、細胞培養(yǎng)物或雞胚組織制作超薄切片，負染后置電鏡下觀察，可發(fā)現(xiàn)球形，有雙層蛋白外膜，直徑55～70nm的藍舌病病毒。

（3）分離培養(yǎng) 病毒培養(yǎng)在綿羊腎單層細胞上，48h左右出現(xiàn)細胞病變，幾天內(nèi)細胞全部感染，之后細胞脫落；感染非洲綠猴細胞后出現(xiàn)空斑，而抗病毒血清能夠抑制空斑的形成。

（4）動物接種試驗 采集病毒液經(jīng)腦感染幼齡小鼠，6d左右出現(xiàn)致死性腦炎，將病毒液分別靜脈或皮內(nèi)接種易感羊和免疫羊，幾天后易感羊出現(xiàn)典型的藍舌病變，而免疫羊確無任何藍舌病相關(guān)癥狀。

2.2 藍舌病血清學檢測方法

2.2.1 瓊脂糖免疫擴散試驗（AGID）

瓊脂擴散試驗為可溶性抗原與相應(yīng)抗體在含有電解質(zhì)的半固體凝膠(瓊脂或瓊脂糖)中進行的一種沉淀試驗。先將BTV用Vero或BHK-21進行擴增和培養(yǎng)，然后將所得的BTV抗原和待檢血清加入到0.9%的瓊脂糖凝膠中，分別設(shè)置陰性對照和陽性對照。該法的特點是在沒有實驗設(shè)備時，可以對大量血清樣品進行檢驗。

2.2.2 血清中和實驗（MTSN）

中和試驗是利用同一病毒的不同型的毒株或不同型標準血清,即可測知相應(yīng)血清或病毒的型。這個方法是將Vero或BHK-21細胞鋪到96孔板中,待細胞的面積占孔面積的80%時,向96孔板中加入不同血清型的病毒，放到37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；與此同時，將待檢血清進行滅活處理，然后按10倍連續(xù)稀釋后加到培養(yǎng)板中，37℃溫箱放置1h，試驗結(jié)果若顯示有1/4的孔中細胞發(fā)生病變則判定為BTV陽性血清。這個方法的不足是試驗的準確性和所測定的效價會受到很多因素度影響，如：細胞培養(yǎng)的條件，培養(yǎng)液的成分，細胞類型等。

2.2.3 過氧化物酶染色法（IPS）

該方法是利用標記抗體來檢測蛋白抗原，該方法主要包括：間接過氧化物酶檢測法（IP）、熒光抗體檢測法(FA)及過氧化物抗過氧化物酶檢測法(PAP)等三種方法。其中敏感性最高的是IP中以抗生物素及生物素的復(fù)合物標記過氧化物酶為基礎(chǔ)的ABC-IP檢測方法，目前在生產(chǎn)實踐中應(yīng)用；其缺點是制備抗原蛋白和相應(yīng)度抗體操作步驟多，而且易受外界影響因素的限制，無法長期保存的原材料。

2.2.4 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）

ELISA是指將可溶性的抗原或抗體吸附到聚苯乙烯等固相載體上，進行免疫反應(yīng)的定性和定量方法。以重組VP7蛋白和抗VP7蛋白的McAb為基礎(chǔ)的競爭ELISA方法作為OIE推薦的BTV血清學診斷方法已經(jīng)商品化。這種方法在檢測藍舌病病毒群特異性抗原時，較間接ELISA、AGID等方法敏感。競爭 ELISA法以抗NS1蛋白單抗和抗VP7蛋白單抗作為檢測用單抗，任何動物體內(nèi)的藍舌病抗體都可以被檢測到。這一方法的優(yōu)點是特異性高，即使樣品中混有EHDV抗體，也不會有假陽性的結(jié)果出現(xiàn)。

2.3 藍舌病分子生物學檢測方法

2.3.1 PCR檢測技術(shù)

PCR是聚合酶鏈式反應(yīng)，又稱體外DNA擴增技術(shù)，用于擴增位于兩段已知序列之間的DNA片段。對于BTV這類RNA病毒需要先進行反轉(zhuǎn)錄，得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA后，以此為模板進行PCR擴增得到BTV片段。利用RT-PCR方法，具有靈敏度高，特異性強，產(chǎn)率高，重復(fù)性好，在感染早期病毒量少時適用于臨床檢測，但這一方法技術(shù)性強，而且比較耗時，需要實驗儀器輔助，在基層較難推廣。

2.3.2 核酸分子雜交技術(shù)

核酸分子雜交技術(shù)是利用不同來源的DNA單鏈與RNA鏈彼此有互補的堿基序列而結(jié)合來檢測相應(yīng)的病原核酸。在BTV核苷酸序列的檢測中，設(shè)計BTV cDNA探針，利用其與BTV病毒RNA進行核酸雜交以檢測BTV抗原。該方法的操作步驟較多，而且樣品需要進行特殊處理，實驗人員需要經(jīng)過長期積累的操作經(jīng)驗才能掌握，并不適用于常規(guī)的病原檢測。

3 結(jié)論

隨著藍舌病對養(yǎng)殖業(yè)危害的加劇，不僅僅是單獨依靠疫苗來控制本病，發(fā)病初期的診斷也至關(guān)重要，目前有很多診斷方法可供我們選擇，如病毒分離鑒定、血清學檢測方法以及分子生物學檢測方法。因地制宜，選擇適合的診斷方法，制定全面有效的監(jiān)測和控制措施將更有利于藍舌病的綜合防治工作。

[1]殷震,劉景華.1997.動物病毒學(第二版).北京:科學出版社,549-554.

[2]董長垣.現(xiàn)代分子病毒學[M].武漢:武漢大學出版，1996.

[3]Huismans H,et al.Characterization of the tubules associated with the replication of three different orbiviruses[J].Virology,1979,92(2):397-406.

[4]Maan S,et al.Complete genome Characterisation of a novel 26th bluetongue virus serotype from Kuwait[J].PLoS One,2011,6(10):26-47.

[5]Squire K R,et al.Detecting bluetongue virus RNA in cell culture by dot hybridization with a cloned genetic probe[J].J Virol Methods,1985,10(1):59-68.

[6]Ritter D G,et al.Genetic relationships of bluetongue virus serotypes isolated from different parts of the world[J].Virus Res,1988,11(1):33-47.

[7]Ismail I M.Bluetongue neutralization test with different Virus under variable conditions[J].Agr Res Rev,1987，65:867-872.