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(1.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅 平?jīng)?744000；2. 平?jīng)鍪修r(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測檢驗(yàn)中心)

鈣蛋白酶系統(tǒng)是廣泛存在于脊椎動物細(xì)胞中的一類半胱氨酸巰基內(nèi)肽酶，是一種主要依賴Ca2+激活的蛋白水解酶，主要由鈣蛋白酶(Calpain)、鈣蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin)及鈣蛋白酶激活蛋白組成。目前發(fā)現(xiàn)的鈣蛋白酶系統(tǒng)的同工酶有至少16種。廣泛存在的鈣蛋白酶根據(jù)其表現(xiàn)出半最高活性所需的Ca2+濃度的不同，主要分為兩種，其中一種是μ-calpain (calpain l)，激活其所需的Ca2+濃度為微摩爾級，另一種為m-Calpain(Calpain2)，激活其所需的Ca2+濃度為毫摩爾級。

1 鈣蛋白酶系統(tǒng)概述

鈣蛋白酶最早是1964年由Gurof等在大鼠腦組織中發(fā)現(xiàn)并分離鑒定出的。后來，又先后從心肌、肝臟等組織中提取獲得鈣蛋白酶。1976年Daytion等人對該酶進(jìn)行了分離純化。1981年被命名為EC3.4.22.17，即鈣蛋白酶或鈣激活蛋白酶。1984年Ohno等第一次克隆出了該酶的cDNA 。1991年，該酶被正式命名為鈣蛋白酶(Calpains)。

1.1 鈣蛋白酶的結(jié)構(gòu)

根據(jù)鈣蛋白酶各同工酶所具有的不同結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，將其分為典型鈣蛋白酶和非典型鈣蛋白酶兩種。典型鈣蛋白酶由80 kD大亞基和30 kD小亞基組成，大亞基分為四個結(jié)構(gòu)域，分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，小亞基由Ⅴ和Ⅵ兩個結(jié)構(gòu)域組成。結(jié)構(gòu)域Ⅰ位于N端，可以和30 kD的小亞基形成二聚體，起到活性調(diào)節(jié)作用；結(jié)構(gòu)域Ⅱ是鈣蛋白酶的核心結(jié)構(gòu)域，在該區(qū)域存在由 Cys-His-Asn 肽殘基構(gòu)成的催化區(qū)域，是鈣蛋白酶表現(xiàn)其水解活性的關(guān)鍵位置；結(jié)構(gòu)域Ⅲ是鈣蛋白酶的活性調(diào)節(jié)區(qū)域；結(jié)構(gòu)域Ⅳ包含了5個鈣蛋白酶所特有的EF-hand結(jié)構(gòu)。典型鈣蛋白酶包括Calpain 1、2、3、8、9、11、12和13，其中Caipain 1、2和9能與30 kD的小亞基形成異源二聚體，而Calpain3、8、12盡管含有結(jié)構(gòu)域Ⅳ，卻不能與30 kDa小亞基相互作用。非典型鈣蛋白酶包括Calpain5、6、7、8b、10a和15，這類鈣蛋白酶沒有結(jié)構(gòu)域Ⅳ，且其它3個結(jié)構(gòu)域存在缺失或者替換，不能與小亞基形成二聚體。

1.2 鈣蛋白酶功能及其作用機(jī)理

研究表明鈣蛋白酶在宰后肌肉嫩化過程中發(fā)揮重要作用，被認(rèn)為是影響肌肉嫩度的基本酶類。但不是鈣蛋白酶的所有成員都對肌肉的嫩化過程起作用，有研究顯示，在肌肉嫩化的過程中，m-calpain的活性幾乎保持不變，而μ-calpain的活性顯著下〗。而鈣蛋白酶活性下降是其發(fā)揮水解作用的體現(xiàn)，因此人們廣泛認(rèn)為是μ-calpain參與肌肉的嫩化，而m-calpain并不參與這一過程。

動物機(jī)體中的Ca2+在正常狀態(tài)下主要存在于肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的 Ca2+的濃度約是10～7mol/L。屠宰后的肌肉在冷卻時會受到刺激，肌質(zhì)網(wǎng)則失去保護(hù)Ca2+的能力，從而Ca2+被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，導(dǎo)致肌纖維細(xì)胞質(zhì)內(nèi)游離的 Ca2+濃度升高到大于10～6 mol/L。因而使Calpain被激活，并且開始降解肌纖維蛋白，使肌纖維的Z盤崩解，肌原纖維破碎，進(jìn)而使肌肉嫩度增加。

1.3 鈣蛋白酶活性調(diào)節(jié)

鈣蛋白酶活性的調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，主要包括Ca2+濃度的正調(diào)控和鈣蛋白酶抑制蛋白的負(fù)調(diào)控。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高后，Ca2+與鈣蛋白酶的EF-hand結(jié)構(gòu)結(jié)合，隨后Calpain的大小亞基分離，發(fā)生自溶現(xiàn)象，構(gòu)像發(fā)生變化，暴露出具有催化活性的半胱氨酸三聯(lián)體結(jié)構(gòu)，從而表現(xiàn)出鈣蛋白酶的水解活性。但只有當(dāng)鈣離子濃度高于2μmol/L時鈣蛋白酶才會被激活，細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度一般為0.2～0.8μmol/L，所以一般情況下鈣蛋白酶處于未激活狀態(tài)。在動物屠宰后，肌漿網(wǎng)內(nèi)的鈣離子釋放，鈣離子濃度顯著升高，激活了鈣蛋白酶，促進(jìn)動物屠宰后肌肉的成熟嫩化。

鈣蛋白酶抑制蛋白(CAST)則是專一性的鈣蛋白酶活性的抑制蛋白。CAST與Calpain結(jié)合的過程是可逆的，這個過程同樣也要依賴Ca2+的參與完成。正常情況下Calpain主要在細(xì)胞膜，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高后，Ca2+則會和Calpain結(jié)合并使其表現(xiàn)對底物水解作用，這時CAST就會競爭性的結(jié)合Calpain，導(dǎo)致Calpain的活性降低，從而防止了Calpain對細(xì)胞的破壞；繼續(xù)提高Ca2+濃度，此時Calpain才會表現(xiàn)其蛋白酶水解活性。除此之外，鈣蛋白酶的活性還受離子強(qiáng)度、pH及底物蛋白磷酸化等因素影響。

2 鈣蛋白酶基因

2.1 CAPN1基因

CAPN1是鈣蛋白酶基因家族研究最多的成員之一，在肌原纖維蛋白降解中起著重要的作用，與肌肉增長和宰后嫩度的變化及蛋白質(zhì)水解程度密切相關(guān)。目前已克隆了人、猴、大鼠、小鼠、雞、豬、兔、牛和牦牛的CAPN1基因的cDNA序列，不同物種的基因序列的結(jié)構(gòu)和長度差異較大。據(jù)GenBank上公布的序列，人的CAPN1基因位于11號染色體上，由22個外顯子和21個內(nèi)含子組成；雞的CAPN1基因位于3號染色體上，由21個外顯子和20個內(nèi)含子組成；小鼠CAPN1基因全長21 kb，含有28個外顯子；牛的CAPN1基因位于29號染色體，該基因的mRNA序列長為26517 bp，由22個外顯子和21個內(nèi)含子構(gòu)成，內(nèi)含子遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于外顯子。

2.2 CAPN2基因

由于大多數(shù)的研究認(rèn)為CAPN2基因不參與肌肉嫩化的過程，因此對該基因的研究相對較少。人的CAPN2基因位于1號染色體上，mRNA長度為3 270 bp，由21個外顯子和20個內(nèi)含子組成；雞的CAPN2基因位于3號染色體上，rnRNA序列長為2 723 bp(NM 2050801)，由21個外顯子和20個內(nèi)含子構(gòu)成；牛的CAPN2基因位于16號染色體上，mRNA長度為3 207 bp；劉仲娜等通過電子克隆技術(shù)與序列分析，得到牦牛的CAPN2基因cDNA全長為3 200 bp，包含一個2 103 bp的開放閱讀框，共編碼700個氨基酸。牦牛 CAPN2 的核苷酸序列與普通牛、羊、馬、豬、小鼠、雞、人相應(yīng)序列間的一致性分別為99%、97%、90%、87%、85%、79%、90%。

2.3 CAPN3基因

CAPN3也是鈣蛋白酶家族中的一個成員，有 CAPN3a(p94)和CAPN3b(LP82)兩個變異剪接體，CAPN3a 有24個外顯子，4個結(jié)構(gòu)域，全長約50kb，分子量為94 kD。CAPN3a通過可變剪切去掉外顯子6、15和16，并且采用不同的核苷酸序列作為外顯子1，就形成了CAPN3b。人類CAPN3蛋白氨基序列與CAPN1的同源性為51%，與CAPN2的同源性為54%。骨骼肌特異性蛋白酶只在骨骼肌細(xì)胞中表達(dá)，其表達(dá)量是普通鈣蛋白酶的好幾倍，呈現(xiàn)出高度的表達(dá)特異性。目前關(guān)于CAPN3 基因的研究，主要集中在CAPN3基因的克隆、多態(tài)性分析、基因表達(dá)差異以及與牛、羊、豬、及雞、鴨等物種肉質(zhì)及胴體重相關(guān)性的分析上，同時在其與人類疾病的相關(guān)性研究中也取得了一定的進(jìn)展。人類CAPN3基因定位于15號染色體上，基因組大約138 kb。mRNA 長度為3 316 bp，由24個外顯子組成。普通牛CAPN3 基因位于第10號染色體。Ilian等研究發(fā)現(xiàn) CAPN3蛋白表達(dá)水平與肉的嫩度存在顯著相關(guān)性，在綿羊上CAPN3蛋白水平和mRNA水平與嫩度具有高相關(guān)性。因此，CAPN3基因也可以作為嫩度性狀的一個候選基因。

3 鈣蛋白酶1(CAPN1)基因與肉質(zhì)相關(guān)性的研究

目前，CAPN1基因作為肉質(zhì)性狀的候選基因報(bào)道較多，并逐漸應(yīng)用于肉品嫩度性狀的標(biāo)記輔助選擇。Susan Castro等研究了CAPN1基因與牛肉色的相關(guān)性，結(jié)果表明，CAPN1基因與肌肉的肉色值沒有顯著相關(guān)性，但作者認(rèn)為該基因仍可以作為研究肉色性狀的一個候選基因。也有大量研究報(bào)道CAPN1基因與畜禽宰后肌肉成熟嫩化相關(guān)。Casas等將影響牛肉嫩度的QTL定位于14和29號染色體，并在CAPN1基因中檢測到316 bp、4 753 bp和5 331 bp的SNPs突變位點(diǎn)，隨后又在瘤牛中發(fā)現(xiàn)同樣的3個SNP突變位點(diǎn)，表明CAPN1基因316位點(diǎn)突變與嫩度存在顯著相關(guān)。Iglesias等采用ARMS-PCR和PCR-RFLP方法對Hereford牛，Brahman牛和 Braford牛群體進(jìn)行研究后在內(nèi)含子17上發(fā)現(xiàn)了一個插入/刪除突變，認(rèn)為該突變是一個非常有價值的與肉質(zhì)相關(guān)的候選基因，并可以幫助解決熱帶地區(qū)舍飼牛的肌肉嫩度問題。Hoyoung Chung等研究表明，CAPN1基因的三個遺傳標(biāo)記與牛肉剪切力顯著相關(guān)，并對剪切力有顯著的累加效應(yīng)，因此可以作為研究肉質(zhì)嫩度的一個候選基因。陸克龍采用PCR-SSCP的方法對靈山土雞CAPN1基因外顯子5進(jìn)行多態(tài)性檢測，發(fā)現(xiàn)2個突變位點(diǎn)，4種不同的基因型，不同基因型在剪切力、肌內(nèi)脂肪含量上存在差異。束婧婷等在清遠(yuǎn)麻雞和隱性白羽肉雞CAPN1基因外顯子5和外顯子6中檢測到3個突變位點(diǎn)，且隱性白羽肉雞中不同基因型個體的剪切力和系水力之間存在顯著差異，因此認(rèn)為該基因的SNPs影響肌肉的剪切力和系水力等性狀，說明該基因可能是影響雞的肌肉嫩度的主效基因連鎖。

也有研究表明CAPN1基因突變除影響屠宰后肌肉嫩度外，也與其他胴體及肉質(zhì)性狀相關(guān)，武秀香等采用PCR-SSCP檢測到雷瓊牛、BMY牛、中國西門塔爾牛和云南高峰牛CAPN1基因兩個多態(tài)位點(diǎn)A4558G和C4684T，其中A4558G突變與胴體產(chǎn)肉率、骨重和肉骨比顯著相關(guān)，C4685T突變對宰前活重、胴體重、凈肉重、網(wǎng)膜油重及腸系膜油重性狀效應(yīng)顯著；張彩霞等在早勝牛CAPN1基因第9外顯子檢測到G458C突變位點(diǎn)，形成GG、GC和CC 3種基因型，該位點(diǎn)與剪切力值、pH和滴水損失存在顯著相關(guān)，CC基因型個體剪切力值和滴水損失顯著低于GG和GC基因型個體。Xin L〗等在5個品種牛中檢測到CAPN1基因的一個多態(tài)位點(diǎn)CAPN1:c947，包含CC、CG和GG三種基因型。該多態(tài)位點(diǎn)與宰后6 days的肉色hue值、肌內(nèi)脂肪含量和大理石紋評分顯著相關(guān)，且CG基因型個體的肉色hue值高于其余兩種純合子的，肌內(nèi)脂肪含量和大理石紋評分為CC基因型個體的高于CG基因型和GG基因型個體的。

4 總結(jié)

鈣蛋白酶是一種蛋白水解酶，不僅在調(diào)節(jié)宰后畜禽肉質(zhì)嫩度方面發(fā)揮重要作用，而且通過對細(xì)胞骨架蛋白、磷酸酶和蛋白激酶的作用，參與肌肉生長、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖與分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程。同時，鈣蛋白酶系統(tǒng)因參與機(jī)體生長、代謝以及肌原纖維更新的過程而與一些疾病密切相關(guān)，但針對具體疾病的相關(guān)機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。