張利坤，井辛宇，白 騰,李 宇，任 發(fā)，溫 飛，康懷艷，李 梅，胡建宏，*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.白水縣畜牧技術(shù)推廣站;3.子州縣畜牧技術(shù)推廣站； 4.白水縣家畜改良站)

近年來(lái)，隨著我國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展，家畜養(yǎng)殖數(shù)量在不斷的增加，養(yǎng)殖規(guī)模在不斷的擴(kuò)大，人工授精技術(shù)也在家畜生產(chǎn)上得到了廣泛應(yīng)用。人工授精技術(shù)在養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用，不僅有效降低了病原菌在家畜交配過(guò)程中的傳播，而且提高了良種公畜的利用率，從而大大減少養(yǎng)殖資金投入，增加養(yǎng)殖收入。家畜人工授精技術(shù)的應(yīng)用離不開(kāi)精液的體外保存，高質(zhì)量的體外保存精液是提高種公畜利用率和母畜受胎率的必然保障。精液冷凍保存便于精液長(zhǎng)期體外儲(chǔ)存和長(zhǎng)途運(yùn)輸，遺傳資源可以跨時(shí)間和跨地域得到應(yīng)用，從而擴(kuò)大了優(yōu)良畜種遺傳資源的應(yīng)用與推廣，加快了優(yōu)良畜種的改良進(jìn)度。雖然精液冷凍保存具有很大的應(yīng)用前景，但是在精液冷凍保存的過(guò)程中，精子細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境會(huì)發(fā)生極大的變化，精子細(xì)胞會(huì)受到不同因素的損傷，包括冷休克、冰晶損傷、氧化應(yīng)激等，造成解凍后精液品質(zhì)下降，嚴(yán)重影響并制約精液冷凍保存技術(shù)的發(fā)展。在精液冷凍的過(guò)程中，精子細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的活性氧，對(duì)精子結(jié)構(gòu)和功能的完整性造成氧化應(yīng)激損傷。大量研究表明，在精液冷凍保存中，外源抗氧化劑能有效減少精子細(xì)胞所產(chǎn)生的過(guò)量活性氧，降低精子的氧化損傷程度，提高凍融后精液品質(zhì)。目前，精子的冷凍損傷機(jī)制和抗氧化劑的篩選，仍需要進(jìn)一步探究。因此，本文主要對(duì)常用抗氧化劑的特性及其保護(hù)精子免受氧化性損傷機(jī)理進(jìn)行綜述，以期為家畜精液的冷凍保存提供一定的理論依據(jù)，為進(jìn)一步發(fā)揮良種優(yōu)勢(shì)提供科學(xué)資料與參考。

1 精子冷凍保存氧化性損傷機(jī)制

在精液冷凍保存的過(guò)程中，精子細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境發(fā)生極大的變化，精子細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)，ROS 攜帶著氧化性極強(qiáng)的自由基，極易與精子質(zhì)膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)或?qū)蛹?xì)胞內(nèi)組織造成損傷，使精子失去正常的生理功能。在正常生理?xiàng)l件下，精子細(xì)胞自身含有抗氧化體系，精子細(xì)胞內(nèi)含有一定濃度的ROS，低濃度的 ROS可以維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性。在冷凍條件下，精子內(nèi)用于消除ROS的抗氧化酶活性會(huì)大大降低，ROS的產(chǎn)生速率超過(guò)機(jī)體內(nèi)抗氧化體系清除ROS的速率，使得精子細(xì)胞內(nèi)ROS含量過(guò)高，造成精子氧化損傷，最終導(dǎo)致精子活率和活力降低。

2 抗氧化劑對(duì)冷凍精子的作用

抗氧化劑是一類(lèi)能夠有效抑制氧化反應(yīng)的物質(zhì)，易與活性氧攜帶的氧自由基結(jié)合，阻止 ROS和精子細(xì)胞質(zhì)膜中的不飽和脂肪酸形成共價(jià)鏈接反應(yīng)，保護(hù)精子免受氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而提高精子的冷凍保存質(zhì)量。因此，外源抗氧化劑添加到精液冷凍稀釋液中，能夠降低精子冷凍過(guò)程中所產(chǎn)生的過(guò)量活性氧，降低ROS對(duì)精子的氧化應(yīng)激損傷程度，提高冷凍精液品質(zhì)?？寡趸瘎┑姆N類(lèi)很多，常見(jiàn)的抗氧化劑可分為酶類(lèi)抗氧化劑和非酶類(lèi)抗氧化劑。

2.1 酶類(lèi)抗氧化劑

超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)。SOD和CAT是精漿和線粒體內(nèi)存在的最基本的抗氧化劑，SOD能將O2-轉(zhuǎn)變?yōu)槿醵拘?H2O2，CAT能夠迅速將H2O2降解為H2O，從而起到保護(hù)精子免受氧化應(yīng)激損傷的作用。

劉超等研究結(jié)果表明，山羊精漿中添加SOD能有效提高精子的活力。Li研究表明，在精液冷凍稀釋液中，添加 CAT 能夠有效提高凍融后精液品質(zhì)。王貞研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)添加SOD或CAT都能改善凍融后豬精液品質(zhì)，但是SOD和CAT組合添加效果更好。

2.2 非酶類(lèi)抗氧化劑

2.2.1 維生素類(lèi)抗氧化劑

維生素C(Vitamin C，VC)又稱(chēng)抗壞血酸，屬于水溶性維生素，具有清除ROS而發(fā)揮其抗氧化作用，有效提高凍融后精液質(zhì)量。權(quán)富生等研究表明，在無(wú)角道塞特綿羊冷凍精液稀釋液中，添加濃度為4.4 mg/mL VC有效提高了精液品質(zhì)。黃俻華研究發(fā)現(xiàn)，600 μg/mL VC可以顯著提高陸川豬解凍后精子活力(P< 0.05)，畸形率顯著降低(P< 0.05)。HU研究結(jié)果表明，4.5 mg/mL VC能顯著改善凍融后精液品質(zhì)，并且能提高精漿中抗氧化酶的活性，有效保護(hù)精子質(zhì)量。

維生素E(Vitamin E，VE)又稱(chēng)α-生育酚，屬于多酚類(lèi)脂溶性維生素，是一種非常有效的預(yù)防誘發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的抗氧化劑。VE易與細(xì)胞膜上的磷脂結(jié)構(gòu)相結(jié)合，阻止ROS和膜脂質(zhì)中的脂肪酸發(fā)生共價(jià)鏈接反應(yīng)，有效減輕精子細(xì)胞受到的氧化應(yīng)激損傷程度，保護(hù)精子的正常性能。趙憲林等研究發(fā)現(xiàn)，在冷凍精液稀釋液中，濃度為0.4～0.8 mg/mL的 VE可以提高秦川牛精液中抗氧化酶的活性，對(duì)精液品質(zhì)具有保護(hù)作用?？得详?yáng)研究表明，關(guān)中驢冷凍精液稀釋液中添加 600 mg/LVE有效提高了解凍后精子完整率和活率。吳大平研究發(fā)現(xiàn)，水牛冷凍稀釋液中添加0.4 mg/mL的VE能夠較好的保護(hù)凍融后精子質(zhì)膜的完整性，同時(shí)顯著提高了GSH-Px酶的活性(P< 0.05)，顯著降低了精子畸形率(P< 0.05)。大量研究表明，VE與其他抗氧化劑組合添加到精液冷凍液稀釋液中，具有更強(qiáng)的抗氧化效應(yīng)。Zhao等研究發(fā)現(xiàn)，在秦川牛精液冷凍稀釋液中，添加0.12 IU/mL VE與和400 IU/mL Vc能有效提高精液中CAT及GSH-Px的活性，起到保護(hù)精液品質(zhì)的作用。

由此說(shuō)明，在家畜精液冷凍保存過(guò)程中，維生素能有效提高凍融后精液品質(zhì)。目前，VC和VE是較為常用的抗氧化劑。VC和VE與其他抗氧化劑的組合效果及其最佳配伍濃度，仍需要進(jìn)一步探求。

2.2.2 氨基酸類(lèi)抗氧化劑

(1)半胱氨酸

半胱氨酸是一種天然氨基酸，屬于含硫非必需氨基酸。半胱氨酸極易被氧化還原成胱氨酸，它具有一定的抗氧化性。因此，半胱氨酸在精液冷凍保存過(guò)程中，可以保護(hù)精子質(zhì)膜免受氧化損傷。有關(guān)研究表明，在牛精液冷凍過(guò)程中，2 mmol/L半胱氨酸可以有效保護(hù)線粒體和頂體的完整性。范楚寧研究發(fā)現(xiàn)，5 mmol/L或7.5 mmol/L的半胱氨酸對(duì)獺兔的精液保存效果最佳。Khalili研究表明，15 mmol/L 的半胱氨酸能顯著提高羊冷凍精液的質(zhì)量(P< 0.05)。

從以上結(jié)論可以看出，不同種類(lèi)動(dòng)物的冷凍保存精液稀釋液中所添加的半胱氨酸濃度差異較大，其原因需要進(jìn)一步的探究。

(2)麥角硫因

麥角硫因是自然界存在較少的天然氨基酸，動(dòng)物體內(nèi)麥角硫因是一種很重要的低分子量硫醇，能夠清除單線態(tài)氧、羥基和過(guò)氧自由基，具有很強(qiáng)的抗氧化性。麥角硫因可以激活抗氧化酶的活性，如谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性。機(jī)體組織代謝中含有微量的麥角硫因，可以螯合二價(jià)金屬離子，麥角硫因與鐵、銅、鋅的代謝密切相關(guān)。

Coyan等研究發(fā)現(xiàn)，在美利奴公羊冷凍精液補(bǔ)充液中，麥角硫因可以保護(hù)精子細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。麥角硫因具有天然無(wú)毒的性能和較強(qiáng)的抗氧化性，其將成為取代其他抗氧化劑的最適選擇。

2.2.3 多糖類(lèi)抗氧化劑

海帶多糖為海帶提取物，具有良好的藥理功效，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、降血壓、抗氧化等。紅景天是一種多年生草本植物。紅景天多糖是紅景天植物的提取物，能夠清除活性氧自由，具有良好的抗氧化性能。另外，多糖具有一定的粘性，可以粘附在精子周?chē)?，提高精子?xì)胞周?chē)臐B透壓，使得胞內(nèi)失水，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶形成，起到保護(hù)精子的作用。張婷研究發(fā)現(xiàn)，精液稀釋液中添加濃度為0.5～1.5 mg/mL的海帶多糖對(duì)豬精子的結(jié)構(gòu)和功能有顯著保護(hù)作用，有效提高了凍融后精液品質(zhì)?？得详?yáng)在關(guān)中驢冷凍精液稀釋液中，1 500 mg/L海帶多糖能有效保護(hù)精子的結(jié)構(gòu)和功能的完整性。HU等結(jié)果表明，海帶多糖能提高精子活率，同時(shí)能增強(qiáng)精漿中抗氧化酶的活性。陳西英研究結(jié)果表明，精液稀釋液中，海帶多糖濃度為1.0 mg/mL對(duì)保護(hù)精子的效果最好。曹華琳將濃度為0.06 mg/mL紅景天添加到牛精液冷凍稀釋液中，能提高解凍后精液中抗氧化酶的活性，降低氧化應(yīng)激損傷程度，保護(hù)精子質(zhì)膜的完整性。

多糖是由單糖通過(guò)糖苷鍵連接而成的化合物，屬于非滲透性保護(hù)劑。多糖具有抗氧化性，它不僅能降低活性氧的量，而且能提高過(guò)氧化酶的活性，最終降低細(xì)胞的氧化損傷程度。另外，在精液冷凍的過(guò)程中，多糖在精子外圍聚集，提高外圍滲透壓，引起細(xì)胞失水，減少冰晶損傷，達(dá)到保護(hù)精子的作用。目前，從眾多研究中發(fā)現(xiàn)，多糖類(lèi)抗氧化劑對(duì)冷凍精子的保護(hù)作用，其組合效果要優(yōu)于單獨(dú)添加的效果。這需要進(jìn)一步探討合適配伍的抗氧化劑及其添加的濃度，期望優(yōu)化冷凍稀釋液的配置，提高家畜精液冷凍保存效果。

2.2.4 其他抗氧化劑

谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是細(xì)胞內(nèi)含有巰基的非蛋白化合物，屬于一種多肽，它通過(guò)巰基發(fā)揮抗氧化作用，同時(shí)具有維護(hù)外源性抗氧化劑的作用。GSH具有抗氧化和抵御細(xì)胞毒性的功能，GSH 可以通過(guò)多種方式保護(hù)家畜精子的氧化應(yīng)激損傷，一方面GSH與氧自由基結(jié)合而直接清除自由基；另一方面GSH可催化GSH-Px 活性，使精子細(xì)胞內(nèi)低毒性的H2O2轉(zhuǎn)化為H2O。另外GSH 能于磷脂結(jié)構(gòu)的細(xì)胞膜形成穩(wěn)定的化合物，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。

據(jù)報(bào)道，在公羊精液稀釋液中，添加2 mL的GSH能夠增強(qiáng)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性，減少了自由基形成和提高了精子活率。康孟陽(yáng)研究發(fā)現(xiàn)，在關(guān)中驢冷凍精液中，1 000 mg/L的GSH可以提高解凍后精子結(jié)構(gòu)完整性和精子活率。段洪云等研究表明，GSH可以與細(xì)胞膜的脂肪酸形成穩(wěn)定的化合物，使精子細(xì)胞免受ROS的氧化損傷。Muhammad等研究結(jié)果說(shuō)明，GSH能保護(hù)綿羊精液凍融后DNA的完整性及提高精液品質(zhì)。

由此可見(jiàn)，GSH具有較強(qiáng)的抗氧化性，對(duì)提高冷凍精液品質(zhì)有一定的作用，可以通過(guò)試驗(yàn)研究推廣GSH的使用范圍。

褪黑素(Melatonin，MLT)是一種胺類(lèi)激素，具有非常強(qiáng)的清除活性氧自由基的功能，通過(guò)抑制氧化反應(yīng)來(lái)保護(hù)細(xì)胞膜脂質(zhì)結(jié)構(gòu)、核酸、蛋白質(zhì)等。褪黑素不僅能夠清除活性氧自由基，而且可以清除自由基的產(chǎn)物，還能促進(jìn)抗氧化酶的表達(dá)，以及降低促氧化酶的活性。楊寶衛(wèi)等研究結(jié)果表明，10 mmol/L的褪黑素能有效降低凍融豬精子的死精子率，有效提高豬凍精品質(zhì)。Amidi等研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素可以提高多種動(dòng)物冷凍精液的質(zhì)量，包括山羊、公豬和牛等。吳大平研究表明，在水牛精液冷凍稀釋液中，添加褪黑素可以降低精子的畸形率，提高凍融后精子活率和抗氧化物酶的活性，其最適添加濃度為0.2 mg/mL。李博玲等研究發(fā)現(xiàn)，添加0.25 mg/mL的褪黑素可有效提高凍融豬精液品質(zhì)。

3 展望

目前，我國(guó)雖然家畜人工授精技術(shù)的應(yīng)用與推廣已取得顯著成效，但是家畜精液冷凍保存技術(shù)仍有很大的發(fā)展空間。隨著家畜精液冷凍保存技術(shù)的深入研究，抗氧化劑改善精液品質(zhì)方面還需要進(jìn)一步探究，如篩選天然植物提取抗氧化劑及不同抗氧化劑組合的實(shí)踐應(yīng)用效果，充分發(fā)揮抗氧劑對(duì)冷凍精子的保護(hù)作用，有助于加速精液冷凍保存技術(shù)的發(fā)展，提高優(yōu)良畜種的利用率，進(jìn)一步推動(dòng)我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展。